摘要
机体内活性氧自由基(ROS)的产生超过自身清除能力时可发生氧化应激(Oxidative Stress)，诱导蛋白质变性、核酸羟基化和脂质过氧化等过程，从而引发细胞功能紊乱、细胞中毒、机体衰老，导致多种慢性疾病的发生。大量的研究表明乳酸菌具有较好的抗氧化活性，对机体氧化应激刺激起到一定的防御和保护作用。本实验室前期从金华火腿中筛选获得一株发酵性能优良兼具高抗氧化活性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NJAU-01，并在体外自由基水平、细胞水平验证了其抗氧化能力，但其在小鼠体内是否发挥抗氧化作用还有待进一步确证。本文通过构建ICR小鼠D-半乳糖(D-gal)衰老模型，研究该菌在小鼠动物体内的抗氧化效果，运用蛋白组学解析NJAU-01缓减小鼠肝脏氧化应激的作用机制，进一步使用16S rDNA测序技术探究NJAU-01对小鼠肠道菌群的影响，从抗氧化酶、蛋白表达和肠道微生物多样性等角度初步探究NJAU-01缓减小鼠体内氧化应激的作用机制，以期为抗氧化型益生菌的开发和利用提供理论基础。主要研究内容如下: 1.Lactobacillus plantarum NJAU-01对小鼠体内抗氧化活性的影响。设置CK组（注射无菌生理盐水，灌胃无菌生理盐水）、D-gal组（注射50g/L D-gal，灌胃无菌生理盐水）、阳性Vc组（注射50g/L D-gal，灌胃0.001g/mL Vc）和低中高剂量组（注射50g/L D-gal，灌胃107，108，109CFU/mL NJAU-01）的ICR小鼠，进行6周的饲喂观察后，脱颈处死、解剖并进行指标测定。结果显示，D-gal处理组的小鼠体重显著低于其他处理组（P＜0.05），心脏和脾脏系数为0.72±0.13和0.27±0.02，分别显著高于CK+中剂量组和CK组(P＜0.05)，肝小叶出现结构不完整和炎性细胞浸润的现象，在阳性Vc组和灌胃NJAU-01的低、中和高剂量组中肝脏的病变症状得到明显缓解;灌胃NJAU-01的处理组在心脏和肝脏的总抗氧化能力T-AOC及抗氧化酶活力如SOD、GSH-Px、CAT显著高于D-gal组(P＜0.05)，qRT-PCR结果显示抗氧化物酶的mRNA水平的表达显著高于D-gal组(P＜0.05);灌胃NJAU-01的处理组同时也显著降低了脂质氧化产物MDA的含量（P＜0.05）。以上结果表明NJAU-01在小鼠体内有效发挥了抗氧化效应，减缓D-gal处理造成的氧化应激损伤。 2.L.plantarum NJAU-01减缓小鼠肝脏氧化应激损伤的蛋白组学研究。SDS-PAGE图谱及定量分析显示CK组、D-gal组、灌胃NJAU-01中剂量组(108CFU/mL)的小鼠肝脏蛋白的相对强度发生了显著性变化，利用串联质谱同位素标记蛋白组学技术探究以上三个处理组中小鼠肝脏蛋白的表达及显著性代谢通路。研究结果显示，三个处理组共筛选出683个显著性差异表达的蛋白(P＜0.05)，差异蛋白主要与细胞骨架、碳水化合物代谢、线粒体代谢、脂质代谢、转录调控、蛋白转运与表达相关，包括CCR4-NOT复合物亚基10蛋白和含有Ras关联结构域的蛋白质6，在D-gal组发生了显著下调，肉碱酰基转移酶(CrOT)等蛋白在中剂量组发生了显著上调（P＜0.05），能够维持细胞稳态，发挥抗氧化作用。关键性差异蛋白的基因Cnot10、Crot、Rex26、Gstm5在qRT-PCR水平进行了验证，其基因表达趋势与蛋白组鉴定结果相一致。通过GO功能注释发现差异蛋白主要分布在细胞内、细胞膜、细胞器、蛋白质复合物等位置;具有结合、催化、分子功能调节、转录调控、运输、抗氧化等功能;参与了机体的细胞过程、代谢过程、生物调节过程、信号传递过程、免疫系统等生物过程。通过KEGG基因注释得到与抗氧化相关的代谢通路有MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和NF-κB信号通路。以上结果表明，NJAU-01可能通过调节通路中的蛋白表达缓解机体的氧化应激，保护机体免受氧化应激的损伤。 3.L.plantarum NJAU-01对小鼠肠道菌群的影响研究。通过16S rDNA测序技术比较了CK组、D-gal组、灌胃NJAU-01中剂量组的小鼠肠道菌群物种分布和丰度变化，探究NJAU-01对肠道菌群的调节作用。结果发现，D-gal诱导造成小鼠的肠道中发酵乳杆菌与厚壁菌门比值降低，厚壁菌门下的梭状芽胞杆菌、变形菌门下的变形菌和Epsilonbacteraeota、衣原体门下的Tannerellaceae、螺旋体门下的Saccharimonadaceae和弯曲菌门下的Campylobacteria等与疾病相关的菌群丰度上升;而灌胃NJAU-01上调了有益菌厚壁菌门的比例，增加了厚壁菌门下的杆状菌、乳杆菌、加氏乳杆菌、Turicibacter;放线菌门下的红蝽菌目、伊格尔兹氏菌科、放线菌门等有益菌的物种丰度，表明NJAU-01通过调节肠道菌群的组成，可能在缓解小鼠氧化应激方面发挥重要作用。
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