摘要
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种以记忆力衰退、学习和认知功能障碍为症状的神经退行性疾病。AD的发病机制复杂，单一靶点并不能有效的阻止病情，多靶点治疗策略已成为抗AD药物研究的新方向。连翘叶具有与连翘果实相似的化学成分，其提取物具有抗氧化、防衰老、抑菌等药理活性。本论文基于AD发病机制中的Aβ级联学说，胆碱能缺失学说，选取连翘叶为研究对象，提取和分离制备连翘叶水提物（以下简称FLE）和连翘叶不同分离物，并对抑制胆碱酯酶活性部位进行了初步筛选；初步探究了FLE抗AD的生物活性；基于课题组前期工作，进一步研究了不同生理条件对连翘酯苷E增强血清蛋白荧光的影响。主要研究内容与研究结果如下： 1.连翘叶抑制胆碱酯酶活性部位初步筛选。通过加热回流提取法、D101大孔树脂柱分离法制得FLE和连翘叶不同分离物：Q1、Q2、Q3、Q4、Q5，并通过HPLC进行成分分析；以胆碱酯酶为筛选指标，采用Ellman法对四个分离物Q2、Q3、Q4、Q5进行抑制胆碱酯酶活性部位的初步筛选。结果表明：FLE中主要含有连翘酯苷E、连翘酯苷I、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁、连翘苷和连翘脂素；各分离部位成分相似，但含量不同。随着洗脱剂中乙醇比例的增大，连翘酯苷E和连翘酯苷I含量减小，连翘苷和连翘脂素含量逐渐增加；筛选出抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性最好的部位是Q2（20%乙醇分离部位），其IC50值为698.97μg/mL。 2.FLE抗AD生物活性初步研究。动态光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS）研究表明：FLE能够减慢Aβ25-35的聚集；Ellman法抑制胆碱酯酶活性实验的结果表明：FLE对胆碱酯酶活性均有抑制作用，且对AChE的抑制效果要强于BUChE；通过DPPH·清除实验和FRAP法测定FLE的抗氧化水平，结果表明：FLE具有一定的抗氧化活性，呈现剂量依赖关系。采用MTT法从细胞角度初步研究FLE对PC12细胞活力的影响，结果表明FLE对Aβ25-35诱导的PC12细胞的损伤具有改善作用。 3.连翘酯苷E与血清蛋白相互作用研究。采用多种光谱技术探讨了在不同生理环境中，连翘酯苷E对BSA或HSA荧光增强作用的影响。结果表明：在弱酸性和中性溶液中，连翘酯苷E对BSA荧光的增强几乎相同，而在碱性溶液中BSA的荧光强度几乎没有变化，HSA也有类似的结果；连翘酯苷E引起的蛋白荧光增强在乙醇溶液中明显大于DMSO和Tris-HCl缓冲溶液；连翘酯苷E对糖基化牛血清白蛋白（gBSA）的荧光影响较小，而对糖基化人血清白蛋白（gHSA）的荧光影响则呈浓度依赖性，原因是BSA的糖基化程度远高于HSA。连翘酯苷E通过形成蛋白-连翘酯苷E复合物而增加蛋白质的内源性荧光，结合比例为1：1。这些研究将有助于了解连翘酯苷E在人体内的传递效率、吸收、分布、稳定性、毒性以及代谢过程。 综上研究表明：FLE具有一定的抗AD作用；不同生理条件对连翘酯苷E增强BSA或HSA荧光具有一定的影响。
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