摘要
随着病原物抗药性和环境污染问题日益严重，生物防治成为一种环境友好的植物病害防治措施。Pseudomonas protegens FD6抑菌谱广，对番茄灰霉病有较好防病效果，本论文旨在利用生物信息学分析FD6产生次生代谢物种类，分离和鉴定新型抗菌肽，为研发绿色安全、新型高效的生物农药提供参考。 antiSMASH分析结果显示FD6全基因组包含17个次生代谢产物合成基因簇，进一步对合成抗生素类物质的基因簇进行分析，Region3和Region10分别合成藤黄绿脓菌素(pyoluteorin，Plt)和2，4-二乙酰基间苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG)。Region16有88％可能为orfamide类环脂肽，根据腺苷酰化结构域进行分析发现，其由10个氨基酸组成，初步预测为L-Leu1-D-Asp2-D-Thr3-D-Ile4-L-Leu5-D-Ser6-L-Leu7-L-Leu8-D-Ser9-L-Val10。此外，通过进一步比对分析发现，防御假单胞菌FD6还产生甲烷氧化菌素(methanobactin)、丰原素(fengycin)、嗜铁素(pyoverdine)等其它抗菌物质。 不同培养基抑菌活性检测发现在PA培养基上FD6拮抗能力最强，且有机溶剂乙酸乙酯和三氯甲烷萃取后的提取物具有较强抑菌活性。对提取物的理化性质检测，结果表示，粗提物可能不是蛋白，还原糖检测显示为阴性，排油圈实验和坍塌实验均表明粗提物具有良好的表面张力。全波长扫描，核磁等都可佐证粗提物中可能含有环脂肽类物质，对其进行高温处理，发现100℃处理粗提物及紫外线处理后仍有抗菌活性。 为提高活性物质的产量，对培养条件进行优化获得最佳发酵条件:发酵培养基为PB培养基，装液量为摇瓶30％、28℃条件下200rpm振荡培养3.5d。根据前期振荡培养条件的优化，发酵罐培养时的条件为28℃、375rpm培养3d。使用乙酸乙酯萃取发酵上清液，初步获得抗菌粗提物28g，以番茄灰霉病菌为指示菌测定抑菌活性，结果显示粗提物具有较强抑菌能力，且对多种植物病原真菌和细菌都有良好的抑菌效果。MALDI-TOF MS显示特征峰集中在1200m/z-1400m/z，最高强度峰经MALDI-TOF MS2分析发现其1317.8m/特征峰为[M+Na]+。 粗提物经凝胶柱层析后得到651管样品，TLC条带集中在16-200管，对展开剂进行优化后显示三氯甲烷∶甲醇=15∶1最适宜。上述结果为进一步鉴定分析环脂肽的化学结构及作用机制奠定基础。
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