摘要
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上种植最广泛的牧草，具有高产、耐逆性强以及适口性好等特性，有“牧草之王”的美称。然而干旱等非生物胁迫严重威胁着紫花苜蓿的生长发育及其产量。本研究利用课题组前期三代PacBio全长转录组测序技术构建的模拟盐（NaCl）、干旱（Mannitol）和外源施加脱落酸（ABA）处理的紫花苜蓿转录组数据库，筛选到一批受非生物胁迫显著诱导的基因。对非生物胁迫中扮演重要防御角色的晚期胚胎发生丰富(LEA)家族基因进行识别鉴定，并构建MsLEA10基因过表达载体，转入拟南芥及紫花苜蓿，对其功能进行进一步验证。主要研究结果如下： 1、根据实验室前期构建的紫花苜蓿模拟盐、干旱和外源施加ABA处理的全长转录组数据库，分析各基因在干旱、盐和ABA处理下的表达量，获得了98个在非生物胁迫下差异表达基因，并从紫花苜蓿CADL数据库、蒺藜苜蓿基因组等网站对差异表达基因表达模式进行调查，筛选获得9个抗逆候选基因。 2、在紫花苜蓿全基因组数据库内筛选获得30个紫花苜蓿LEA基因家族成员序列并对其进行生物信息学分析。通过进化分析将其分为LEA_1-LEA_6、Dehydrin和SMP8个亚族，按蛋白ID号从小到大排序后命名为MsLEA1-MsLEA30。表达模式分析结果表明，LEA基因具有组织表达特异性，且大部分基因的表达与胁迫耐受性有关。亚细胞定位预测结果显示，LEA蛋白在各细胞器中广泛分布。根据LEA基因在非生物胁迫处理下的qRT-PCR验证和抗逆基因筛选结果，拟选择MsLEA10基因进行耐旱功能分析。 3、构建MsLEA10基因过表达载体并转化拟南芥和紫花苜蓿，对MsLEA10过表达拟南芥进行了基因功能验证。MsLEA10属于LEA_3亚族蛋白，含有2个外显子和1个内含子，亚细胞定位在内质网、细胞核和质膜中。通过干旱胁迫平板上的根长表型评价表明，MsLEA10过表达拟南芥根长显著大于野生型；土壤干旱处理后存活率和叶绿素含量统计结果表明，MsLEA10过表达拟南芥具有一定的土壤干旱耐受性；光合相关指标及生理指标测定结果表明，MsLEA10基因能够提高拟南芥的耐旱能力。通过遗传转化获得过表达MsLEA10紫花苜蓿阳性苗，MsLEA10在紫花苜蓿中的耐旱能力有待进一步分析。
NETL