摘要
有机氯代污染物广泛存在于多种环境介质中，在空气、水、土壤、沉积物和生物群样品中都可检测到它们的存在。环境中的有机氯代污染物来自于化工废水、农药的生产和使用、工业材料的使用、垃圾焚烧以及氯消毒的副产物等。有机氯代污染物会造成生态环境的污染、加剧了人类健康风险、危害了野生动植物种群的多样性。研究有机氯代染物降解和代谢的方法有物理法、化学法和生物法等。其中，生物法是从不同的菌株中提取出可以处理污染物的酶来解决严峻的环境污染问题。理解酶催化外源污染物在生物体内的代谢转化机制，对于评价环境污染物的转化归趋、清洁生产、毒理效应以及健康风险等具有重要意义。研究酶及酶催化反应的方法多种多样，可分为实验研究和计算模拟研究两类。其中计算模拟以量子化学方法为基础，可以在微观尺度上研究反应机理，探索环境污染在酶作用下的转化路径和产物分布。同时可以捕捉和定性实验方法中无法检测到的活性中间体，减少实验方法的盲目性，增强对酶催化反应的理解和应用。分子动力学(MD)和量子力学与分子力学联用(QM/MM)的方法是研究酶及酶催化反应的重要工具。 本文采用MD、密度泛函理论(DFT)和QM/MM的方法研究了典型氯代有机污染物的转化归趋，通过计算模拟对它们的降解和代谢机理进行了预测分析。探讨了酶中关键氨基酸的作用，并结合Rosetta软件为设计高效的酶变体提供了理论依据。通过对酶催化反应机制的微观研究，补充验证了实验方法的结果，完善了对酶催化反应的认识并促进了其在环境领域的应用。详细研究内容包含以下四部分: 一、粘康酸内酯化酶对氯代粘康酸的内醇化机机理 氯代粘康酸是氯苯在降解过程中重要的有毒中间产物。本论文使用QM/MM方法，在原子水平上研究了粘康酸内酯化酶（anti-MLE）对两种同分异构的氯代粘康酸（2-cis，cis-氯代粘康酸和3-cis,cis-氯代粘康酸）的内酯化降解过程。反应的机理分为两步，第一步是分子内的成环反应，第二步是氢转移过程。同一种底物在酶空间的摆放位置不同会影响反应的机制，所以在研究中提出了两种氯代粘康酸在anti-MLE作用下的四种反应模型，并提供了反应中不稳定中间体的构型。结合单点能计算绘制出四种反应模型的势能剖面图，并指出了两种氯代粘康酸在酶环境中的优势反应路径。结合DFT计算，对比了非酶环境与酶环境下的催化反应能垒，验证了酶促反应的高效性和专一性。利用氨基酸静电影响分析，为后续设计高效酶变体提供了理论指导，3-cis,cis-氯代粘康酸中的氨基酸残基Arg51、Gln294以及2-cis，cis-氯代粘康酸中的Asn193，可以作为修饰酶的定向突变对象。本论文明确了氯代粘康酸的降解机理，完善了氯苯及其衍生物的降解路径，同时也为高效酶变体的设计提供了理论指导。 二、非血红素2,3双加氧酶的催化反应机理 联苯2，3-二加氧酶(BphA)是有氧降解联苯及多氯联苯过程中的第一个Rieske型酶，在环境中芳香族污染物的降解过程中起着关键作用。本论文采用QM/MM方法研究了工程酶BphAEⅡ9催化下联苯和4，4'-二氯联苯的降解转化机理。研究了[FeⅢ-OOH]2+作用下的的双加氧过程，反应过程包含三个步骤，第一步生成环氧化中间体的步骤是协同反应机理，并为整个双加氧反应的速控步，经过第二步反应生成了碳正离子中间体，最后一步是含铁络合物与碳正离子底物之间的相互作用。通过氨基酸静电影响的分析并结合Rosetta氨基酸耐受序列分析，提出可以通过对氨基酸Phe227、Val287、His323、Leu333、Ile336、Arg340和Thr341进行突变修饰，将它们作为未来定向突变研究的重点目标，以提高联苯类化合物在环境中的降解效率。本论文补充完善了BphA降解联苯类化合物的机理，为BphA的酶工程研究提供了突变位点和候选残基的参考。 三、P450酶活性中心催化转化2，2'，3，3'，6，6'-六氯联苯的机制研究 细胞色素P450酶(CYPs)在多氯联苯(PCBs)的生物转化中起重要作用。本论文应用MD模拟，QM/MM和DFT方法研究了CYP2B6催化PCB136的代谢活化和转化过程。发现PCB136首先被CompoundⅠ催化转化，在Cα和Cβ位点发生的亲电加成会生成不同的活性中间体，酮式中间体或者环氧化中间体。苯环碳原子上的π亲电加成反应是反应的速控步，且发生在Cβ的亲电加成能垒比Cα上的高10.9kcal/mol，Cα是亲电加成反应的优势位点。并探究了生成的活性中间体在不同活性氧簇自由基作用下进一步转化为毒性更强的羟基化产物的过程，预测的主要产物与前人的产物检测实验结果相符。通过非共价相互作用、静电相互作用等多种分析阐明了十个氨基酸残基在底物识别和反应中的关键作用，其中氨基酸残基Val367对亲电加成反应有明显的抑制作用。通过计算也补充证实了实验上卤素-π相互作用是CYP2B6对卤代环境污染物的高亲和力和选择性代谢重要因素的猜想。在忽略周围氨基酸残基作用的前提下，形变能-相互作用能分析中，π亲电加成反应仍具有较高的形变能。对于存在相似反应机理的PCB136降解研究，本论文的结果指出，可以通过导入基因突变以降低反应中较高的形变能来指导微生物降解PCBs的研究。 四、P450酶活性中心催化双氯芬酸的研究 双氯芬酸(DCF)作为一种新兴环境污染物，带来了亟待解决的环境污染问题成为全球环保主义者关注的主题。本论文利用MD模拟、氨基酸相互作用分析以及蛋白虚拟突变设计，研究了提升对DCF降解效率的酶变体突变候选残基。通过计算替换氨基酸后蛋白质-配体复合物的自由能变化来评估残基间的相互作用对复合物稳定性的贡献，复合物的稳定性也决定着DCF的降解效率。采用MD模拟确定了5个结构柔性区域，通氨基酸相互作用网络(RIN)结构和中心度分析选定扰动残基的序号，结合Rosetta确定突变位点并计算突变体与野生型酶的自由能变化情况，在270个突变体中选定了R70A/G/K、F82V/S/K/N/E/Q、V85A/H、L177V、L178Y、R190M/Q、A241G/I/D/E/M和T245H/EW等25个具有明显提升作用的突变候选。为提升CYP105D7对DCF的降解效率提供了理论依据，且为分子改造实验提供了候选残基。
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