摘要
目的: 筛选和鉴定直接靶向ASC的去泛素化酶;阐述去泛素化酶通过调控ASC的分子机制。 方法: 1.筛选直接靶向ASC的去泛素化酶 通过外源过表达实验，初步筛选影响ASC斑点数目的去泛素化酶;进一步，通过基于细胞过表达体系的去泛素化实验确定其是否能够直接干预ASC的泛素化;合成上述筛选出的去泛素化酶的小干扰RNA，检测其能否影响IL-1β的分泌，最终确定USP3作为后续研究对象。 2.CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除USP3的THP-1细胞系 首先将人源USP3基因的sg RNA构建到plenti crispr-V2载体中，将测序正确的plenti CRISPR-V2-USP3以及病毒包装质粒按照特定比例转染到HEK293T细胞中，包装成慢病毒。进一步，将慢病毒感染THP-1细胞，感染48小时之后，依据细胞形态加入嘌呤霉素进行筛选。筛选后将稳定生长的细胞按照每孔单个细胞的数量进行铺板，待细胞长成细胞群落之后，通过Western blot检测敲除效率，结合全基因组测序的结果确定可以稳定敲除USP3的单克隆细胞。 3.检测USP3对ASC的去泛素化调控作用 3.1将Myc-ASC、Flag-USP3野生型/酶活失活突变型以及HA-Ub在HEK293T细胞中共转染，利用anti-Myc Ab进行免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP），通过Western blot检测ASC的泛素化。 3.2体外去泛素化实验:在HEK293T细胞中共转染Flag-USP3和HA-Ub，使用Anti-Flag Gel进行免疫沉淀，将泛素化的ASC富集下来。同样通过在HEK293T中过表达Flag-USP3，体外纯化蛋白，将纯化好的蛋白加入到泛素化的ASC的裂解液中，37℃孵育30分钟，再次免疫沉淀ASC，而后Western blot检测ASC泛素化水平。 3.3内源去泛素化实验:取小鼠腹腔巨噬细胞和稳定敲除USP3的细胞系，给予炎症小体刺激，免疫沉淀ASC，通过Western blot检测ASC的内源泛素化情况。 结果: 1.USP3依赖其去泛素化酶活性直接调控ASC的去泛素化 首先通过外源过表达75种真核去泛素化酶，初步筛选出与ASC相互作用的分子，并通过体外去泛素化实验检测其是否能够靶向ASC并干预ASC的泛素化修饰。进一步，合成了以上筛选得到的去泛素化酶的siRNA，在小鼠腹腔巨噬细胞中敲低各个去泛素化酶，对上清中IL-1β的分泌进行检测。基于以上逐步筛选，最终确定以USP3为接下来的研究对象。更进一步，在HEK293T细胞中过表达USP3野生型或者酶活失活突变体、HA-Ub以及Flag-ASC，利用anti-Flag Ab进行IP，通过Western blot实验发现USP3可以以酶活依赖式地方式调控ASC的泛素化。为了近一步明确USP3在生理条件下的调控功能，通过在小鼠腹腔巨噬细胞和敲除USP3的THP-1细胞系中进行内源泛素化实验，检测敲低或敲除USP3后ASC的内源泛素化水平变化。实验结果显示，敲低或敲除USP3可明显增加ASC的泛素化水平。同时，为了检测USP3是否对ASC有直接去泛素化作用，在体外开展了去泛素化实验并证明USP3可在体外酶活体系直接去泛素化ASC。以上结果证明，USP3直接调控ASC的泛素化是依赖它的去泛素化酶催化活性的。 2.USP3与ASC相互作用 为了进一步确定USP3是否是通过与ASC相互结合进而调控其泛素化，首先在HEK293T细胞中共转染USP3和ASC，利用Flag标签做免疫沉淀，Western blot检测到USP3和ASC有结合作用;为了近一步明确以上结果，分别在小鼠腹腔巨噬细胞和THP-1细胞系中进行了内源的蛋白结合实验，给予炎症小体刺激LPS和ATP后，免疫沉淀ASC，通过Western blot检测到USP3和ASC能够发生明显的结合作用。为了进一步确定两者是否会直接结合，通过体外纯化蛋白的方式将USP3和ASC蛋白体外孵育，免疫沉淀ASC，结果发现USP3和ASC在体外存在直接的结合作用。与此同时，通过在HEK293细胞系中过表达和Flag-USP3和GFP-ASC，通过免疫荧光实验发现USP3和ASC在核周有共定位，以上结果表明，USP3结合ASC。接下来进一步确定了USP3和ASC结合发挥作用的关键结构域，在HEK293T细胞中过表达Flag-USP3、Flag-USP3-UCH、Flag-USP3-ZnF和Myc-ASC、Myc-ASC-CARD以及Myc-ASC-PYD，可通过anti-Flag Ab或者anti-Myc Ab进行免疫沉淀，通过Western blot检测分析。实验结果显示，USP3是通过UCH结构域与ASC的CARD结构域有明显的结合作用。因为炎症小体是多分子的复合物，需进一步确定USP3是否与其他组分结合，在HEK293T细胞中共转染Flag-USP3与Myc-ASC、Myc-Caspase-1以及Myc-NLRP3，免疫沉淀USP3，经过Western blot检测，结果显示USP3特异性结合ASC，而不与NLRP3以及Caspase-1结合。 3.USP3通过与ASC相互作用调节ASC的稳定性 由于不同的泛素化修饰形式会产生不同的功能，因此需进一步明确USP3主要调控ASC的泛素链类型。首先在HEK293T细胞中共转染Flag-USP3、Myc-ASC以及不同类型的泛素，包括野生型(WT)、K27、K29、K33、K48、K63等，利用anti-Myc Ab免疫共沉淀ASC，通过Western blot检测到USP3主要是去除ASC上K48、K29、K33类型的泛素化修饰。由于K48泛素化修饰常与蛋白的降解有关，因此首先在HEK293T中梯度过表达野生型USP3，结果发现ASC的蛋白呈下降的趋势，并且有剂量依赖性，但是USP3的酶活失活突变体却没有发挥这一作用。该实验证明USP3是通过它的酶活来调控ASC蛋白稳定性。细胞中蛋白降解主要有蛋白酶体降解和自噬溶酶体降解途径。进一步检测了USP3主要影响ASC的降解形式。取稳定敲除USP3的THP-1细胞系，通过给予炎症小体的刺激之后，检测ASC蛋白的表达变化，发现在加入蛋白酶体降解的抑制剂MG-132之后，ASC的降解得到了有效的缓，而自噬溶酶体抑制剂CQ和3-MA的加入并没有影响ASC的降解。以上结果证明，USP3主要是通过影响ASC的蛋白酶体降解，从而发挥增强ASC蛋白稳定性的作用。 4.USP3通过对ASC去泛素化作用影响炎症小体信号通路激活 通过前期研究，明确了USP3调控ASC的机制。因为ASC是炎症小体组装过程中的重要组分，因此想进一步考察USP3是否影响炎症小体信号通路激活。在小鼠来源的原代腹腔巨噬细胞中使用siRNA干扰USP3，LPS和ATP处理不同时间点后收取蛋白，通过Western blot检测caspase-1和IL-1β表达与分泌的变化。实验结果表明，siRNA敲低USP3后，IL-1β剪切片段(p17)和caspase-1剪切片段(p20)分泌明显减少，同样地，在USP3敲除的THP-1细胞系中重复了此实验，得到了一致的结果。以上结果提示，USP3是正向调控炎症小体激活。 5.USP3通过对ASC去泛素化作用影响炎性细胞因子分泌 Pro-caspase-1自剪切后，产生p20和p17片段，形成异源二聚体，继而对IL-1β的前体进行剪切。取小鼠来源的腹腔巨噬细胞，使用siRNA干扰USP3，LPS和ATP处理，使用ELISA试剂盒对细胞因子进行检测。实验结果显示，使用siRNA敲低USP3后，细胞培养上清中IL-1β显著减少，TNF-α和IL-6分泌没有明显变化。同时，用炎症小体的另一种激活剂Nigericin(Nig)处理细胞，得到同样的结果。在USP3敲除的THP-1细胞系中重复了以上实验，同样得到了一致的结果。以上实验结果提示，USP3能够正向调控炎症小体激活。 结论: 1.USP3与ASC直接结合并催化其发生去泛素化反应。 2.USP3对ASC发生去K48位泛素化作用，抑制ASC降解，促进了蛋白稳定。 3.USP3可以通过调控ASC的稳定性正向调控炎症小体激活。
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