摘要
结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是世界第四大致死性癌症，其发病率和死亡率在中国恶性肿瘤中也分别位于第三位和第五位，严重威胁人类的生命健康。由于早期的结直肠癌患者往往不表现出临床症状，大部分的结直肠癌被发现于中晚期，患者预后较差。目前临床仍然缺乏针对多数结直肠癌患者疗效显著的药物，正在使用的多种药物只对部分患者产生疗效，因此，更有效的药物和治疗靶点亟待人们发现。 结直肠癌的发生和发展受到环境、遗传、免疫失调等各种因素的影响，其中炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）导致的炎性信号通路激活，肠组织的损伤是结肠炎相关结直肠癌发生(Colitis-associated Colorectal Cancer,CAC)的核心要素之一。结直肠组织中存在的巨噬细胞等免疫细胞及各种炎性因子参与的炎性事件，肿瘤治疗过程中产生的死亡细胞导致的免疫炎性微环境等都大大增加了结直肠癌的复杂性及临床治疗的难度。开发新型药物，调节巨噬细胞参与的炎性微环境正成为临床治疗结直肠癌的方向。 CD169+巨噬细胞是不同于M1和M2型巨噬细胞的一个独特的巨噬细胞亚群。已有研究报道CD169+巨噬细胞在几种自身性免疫疾病中发挥至关重要的作用。之前的研究结果也表明，CD169+巨噬细胞在结肠炎患者的结肠和淋巴结中显著增加，并且发挥加重结肠炎症的作用。因此，CD169+巨噬细胞是否参与癌症发生发展过程中的炎症反应，也是亟需确定的问题。 研究表明，抗炎药物，如阿司匹林和地塞米松，通过调节CRC的肿瘤微环境，在抑制肿瘤方面具有巨大的潜力。同时，广泛存在于各类水果蔬菜中的小分子的酚类化合物—花色苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)已被证明具有抗炎的作用。课题组前期研究报道，在葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS)诱导的结肠炎中，C3G通过调节免疫微环境，抑制CD169+巨噬细胞来发挥抑制炎症的作用。因此，C3G是否能够具有抑制结直肠癌的作用是本课题研究重点关注的焦点。明确C3G抑制结直肠肿瘤的作用、探索C3G是否通过CD169+巨噬细胞发挥抗肿瘤作用将为结直肠癌的预防和治疗提供新的药物和潜在靶点。 目的: 利用AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌(Colitis-associated Colorectal Cancer,CAC)动物模型以及结直肠癌皮下成瘤模型，明确C3G在小鼠结肠癌中的治疗效果，探索其是否通过调节CD169+巨噬细胞为核心的免疫微环境发挥抑制结肠癌的作用。同时，探讨CD169+巨噬细胞在结直肠癌尤其是结肠炎相关结直肠癌(CAC)中的作用，探索其是否通过抑制炎症从而抑制结直肠癌的发生。从而为结肠癌新型药物的研发提供具有理论价值和临床应用潜能的实验数据，为预防和治疗结直肠癌提供新的治疗思路和新靶点。 方法: 课题从动物、细胞、分子水平探讨了C3G对于结直肠癌的干预效果、细胞因子的表达水平、免疫细胞数量及活化状态的变化及相关机制。一系列体外的细胞实验，例如:CCK8，Transwell等实验证明CT26和HCT116结肠癌细胞在不同剂量的C3G的处理下的增殖和迁移能力的变化。免疫荧光和流式细胞术检测C3G刺激后的CT26细胞的凋亡和细胞周期的变化。Westem blot方法检测C3G处理后的肿瘤细胞凋亡和增殖通路中的蛋白表达水平变化。动物实验用BALB/c-WT小鼠和以BALB/c为背景的CD169-DTR小鼠诱导结肠癌的皮下成瘤模型，成瘤期间瘤内注射C3G或者腹腔注射DT，观察肿瘤的变化。qPCR和流式细胞术检测肿瘤和脾脏内各种炎性因子和免疫细胞的变化。以C57BL/6小鼠为背景的CD169-DTR小鼠经AOM注射，后连续接受2.5％DSS水溶液七天，再喂水两周，如此反复三次，诱导结肠炎相关结直肠癌(CAC)模型。期间每3天给小鼠注射DT，观察肿瘤的生长情况。H&E染色展示不同疾病阶段的组织学病理变化。qPCR检测各种炎性因子的表达水平变化。 结果: 首先，体外实验表明，C3G诱导结肠癌细胞凋亡，并抑制结肠癌细胞迁移。其诱导凋亡是通过将结肠癌细胞阻断在细胞周期的(G2期，并靶向结肠癌细胞表面的EGFR，抑制EGFR信号通路，从而激活细胞内源性凋亡信号通路，抑制肿瘤细胞增殖。体内注射C3G可以观察到肿瘤明显减小。对肿瘤免疫微环境的检测发现，C3G降低Ⅰ型IFN的表达，同时降低CD169的表达，并且肿瘤和脾脏内CDS+T细胞数量增加。这些都表明了C3G对结肠癌的抑制作用。用CD169-DTR小鼠诱导的结肠癌模型，CD169+巨噬细胞被DT清除的小鼠中肿瘤变小，肿瘤内CD8+T细胞数量增加。而且，AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌(CAC)模型中，CD169+巨噬细胞清除的CD169-DTR小鼠炎症减轻，结直肠肿瘤变小、甚至肿瘤生长受到抑制，同时炎症阶段的各种炎性因子的表达水平也显著下降。 结论: 本课题证实了C3G对小鼠结肠癌在体内和体外都具有显著的抑制作用、阐明了其作用机制。C3G抑制结直肠癌一方面通过靶向肿瘤细胞表面的EGFR抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡;另一方面调节肿瘤免疫微环境，抑制Ⅰ型IFN和CD169表达。同时，在小鼠的结肠癌皮下成瘤模型中，当CD169+巨噬细胞缺失时，肿瘤明显变小。在AOM/DSS诱导的炎症驱动结直肠癌模型中，同样当CD169+巨噬细胞缺失时，结直肠炎症程度减轻，同时结直肠肿瘤数量和大小受到抑制。由此可以推断，C3G可以作为结肠癌预防和治疗的潜在药物，以及CD169+巨噬细胞可以作为结直肠癌预防和治疗的潜在靶点。然而，CD169+巨噬细胞在结直肠癌中的作用机制还需进一步研究。
NETL