摘要
动物皮是指动物表面的皮肤或软质表层，一些动物皮肤表面还有裘毛。因为其保暖、坚韧、柔软、富含胶原蛋白等特性，动物皮从古至今都是一种广泛应用的资源。 早在夏商朝代，在棉花还没有被用来做棉被和棉衣时，古人就开始用兽皮来保暖。不仅是在服饰业，动物皮在饮食和保健方面也有早应用。先秦时期便有记载:“鹿胶青白、马胶赤白、牛胶火赤、鼠胶黑、鱼胶饵、犀胶黄”。发展至今，市面上已经商品化并且被大众食用比较多的是，以驴皮为原料的阿胶和以黄牛皮为原料的黄明胶。它们因其补血益气和增强免疫力等功效被人喜爱。随着科技的发展，生产商开始运用科技手段提取动物皮中的胶原蛋白和糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG），将它们作为添加物加入化妆品、保健品等产品中，又或者做成生物医学材料。它们在保湿、促进伤口愈合、提高免疫力等方面有突出功效。但后来人们发现不同的动物皮制作的胶有不同功效。例如:驴皮胶能补血，但马皮胶是破血的，与驴皮胶的功效完全相反。误食马皮胶的孕妇会有流产的风险。所以，研究不同动物皮中有功效的主要成分的结构和活性差异，对此类食品、药品、生物材料的研发和质量控制有重大意义。 本论文研究猪皮、牛皮、驴皮的胶原蛋白和GAG的结构和免疫活性差异，探究不同物种的胶原蛋白和GAG的结构与免疫活性间是否有联系，以及胶原蛋白和GAG的免疫促进作用是否有协同性。结构部分主要借助液相与质谱联用的分析技术来完成，而免疫活性部分用巨噬细胞来做评测。 本论文的研究成果如下: 1.猪皮、牛皮、驴皮来源的胶原蛋白的提取及分析 模拟动物皮胶类产品的熬制过程，从猪皮、牛皮和驴皮中用热提取的方法提取出胶原蛋白粗品（Z-P、N-P和L-P），鲜皮中的提取率分别为49.08％、41.72％和46.23％。根据BCA法测蛋白浓度的结果，计算制备的Z-P、N-P和L-P的蛋白纯度分别为93.00％、95.00％和92.00％。纳升液相色谱-二级质谱联用(NanoLC-MS/MS)结果显示，三种动物皮中提取的胶原蛋白粗品中均含有其他蛋白，为白蛋白和原纤维蛋白。 2.猪皮、牛皮、驴皮来源的糖胺聚糖的提取及分析 对猪皮、牛皮和驴皮进行预处理、酶解除蛋白、GAG粗品醇沉、GAG纯化的步骤后，得到三种动物皮的GAG精品（Z-G、N-G和L-G）。鲜皮中的提取率分别为0.10％、0.14％和0.09％。根据DMMB法测GAG浓度的结果，计算制备的Z-G、N-G和L-G的纯度分别为90.40％、91.95％和96.65％。然后对制备的GAG完全酶解后，进行液相色谱-串联质谱-多反应监测(LC-MS/MS-MRM)分析。结果显示制备的三种动物皮的GAG组成相似，约为61-66％的硫酸乙酰肝素(HS)和34-39％的硫酸软骨素(CS)。它们的HS和CS的二糖组成和结构有异同点。从二糖组成来看，相同点为均不含有△TriS CS，不同点为L-G的△IS-△IVS较多而△IA-△IVA较少。从二糖的结构来看，相同点为三种皮CS的二糖结构差距不大，HS的葡糖胺(GlcN)的6位硫酸化程度比较高。而不同点为L-G的HS的葡糖胺(GlcN)的N位硫酸化程度较高，乙酰化程度较低。 3.不同物种皮肤来源的胶原蛋白和糖胺聚糖对巨噬细胞的非特异性免疫功能的影响 使用制备的Z-P、N-P、L-P、Z-G、N-G、L-G、Z-P+G、N-P+G和L-P+G作为药物添加到小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养基中，通过CCK-8法和中性红法分别测定RAW264.7细胞的增殖能力和吞噬能力，来研究三种皮的胶原蛋白和GAG的免疫活性。首先用L-P、L-G和L-P+G探究促RAW264.7细胞增殖和吞噬的最适浓度，结果分别为50μg/mL的胶原蛋白、50μg/mL的GAG、胶原蛋白和GAG各50μg/mL。然后用对应的以上浓度的Z-P、N-P、L-P、Z-G、N-G、L-G、Z-P+G、N-P+G和L-P+G进行促RAW264.7细胞增殖和吞噬的能力的比较。所有的组别均能提高RAW264.7细胞的增殖和吞噬能力，综合来看能得到如下结论:(1)从成分的角度来看，促RAW264.7细胞免疫活性提高最好的是最适浓度条件下的GAG，其次是胶原蛋白和GAG的混合物，最后是胶原蛋白;(2)从物种的角度来看，其皮肤中的胶原蛋白和糖胺聚糖促RAW264.7细胞免疫活性提高的能力从低到高为:猪、牛、驴;(3)结合物种和成分综合来看，提高RAW264.7细胞免疫活性能力从低到高为:Z-P、N-P、Z-P+G、L-P、Z-G、N-G、N-P+G、L-P+G、L-G。值得一提的是三个物种GAG的免疫活性强弱与上一章节中测得的HS硫酸化程度高低的趋势相同，所以猜想两者之间有关联。但是还需要做进一步实验验证。 综上，本论文从猪皮、牛皮和驴皮中提取胶原蛋白和糖胺聚糖，对他们进行结构的表征，并将它们作为药物添加到RAW264.7细胞的培养基中，检测巨噬细胞增殖能力和非特异性免疫中的吞噬能力。另外，在此过程中探究GAG的免疫活性是否与其结构有联系，以及胶原蛋白和GAG间是否能够协同作用以调节RAW264.7细胞活性。本研究旨在比较相近物种皮肤的成分、结构与免疫活性的差异，也对肿瘤病人或有免疫缺陷的病人的药物开发提供建议，以及为该类疾病的治疗提供新的思路。
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