摘要
黄素单加氧酶(flavin-containing monooxygenase，FMO)普遍存在于哺乳动物组织的内质网中，参与对含硫、氮、磷、硒等亲核外源物的氧化代谢，被认为是一类重要的解毒代谢酶。目前有关哺乳动物FMO参与药物解毒代谢（包括农药）的研究已有较多报道，但除解毒代谢外，FMO是否还有其他生理目前仍是未解之谜。昆虫FMO是否同样具有对杀虫剂的解毒代谢能力也未见研究报道。本研究将在前期本实验室发现抗性甜菜夜蛾具有较高FMO表达水平的基础之上，通过采用UAS/GAL4二元表达系统构建过表达或下调表达FMO基因的转基因果蝇系，测定FMO表达上调或下调转基因果蝇系对杀虫剂敏感性的变化来探讨FMO对杀虫剂的解毒代谢能力，同时研究FMO对糖脂代谢的影响，为进一步明晰FMO的功能进行了FMO蛋白的体外表达。另一方面，探讨了芥子碱和L-肉毒碱等季铵类化合物对果蝇虫体及胚胎细胞(S2)糖脂水平的影响，研究结果对揭示FMO的生理、毒理功能具有重要意义。 一、FMO基因沉默或过表达影响黑腹果蝇对杀虫剂的敏感性 利用UAS/GAL4二元表达系统构建了FMO基因过表达与基因沉默型果蝇品系，采用饲料感染法测定了FMO1和FMO2基因过表达型、基因沉默型果蝇以及野生型果蝇对9种类型的15种不同杀虫剂的敏感性。结果表明，FMO1与FMO2下调表达与上调表达显著影响果蝇对硫双威、茚虫威、氰氟虫腙的敏感性水平，FMO1与FMO2表达水平变化对吡虫啉、三氟氯氰菊酯、甲胺磷、毒死蜱这4种杀虫剂敏感性的影响并不完全一致，2个FMO表达水平的变化对甲基嘧啶磷、乐果、溴虫腈、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、杀虫单、灭多威、噻虫啉的毒力则没有显著影响。这些结果表明，硫双威、茚虫威、氰氟虫腙这3种杀虫剂既能被FMO1也能被FMO2所代谢而解毒，而吡虫啉、三氟氯氰菊酯、甲胺磷、毒死蜱则只能被其中一种FMO代谢解毒，甲基嘧啶磷、乐果、溴虫腈、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、杀虫单、灭多威、噻虫啉则不能被FMO代谢解毒。 二、芥子碱、L-肉毒碱等对果蝇糖脂水平的影响 文献报道FMO与心血管疾病有关系，影响糖脂代谢水平，但其机理并不清楚，本实验室魏琪博士通过代谢组学分析发现，果蝇体内FMO表达水平的升高或下调显著影响体内芥子碱的水平，暗示FMO可能代谢芥子碱这类具有季铵碱的化合物，所以本研究探讨芥子碱及其结构类似物肉毒碱、三甲胺等化合物对果蝇糖脂水平的影响，以了解FMO对糖脂代谢的调控作用。L-肉毒碱和芥子碱处理S2细胞后，细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和葡萄糖水平显著降低，其中芥子碱还使细胞内糖原水平下降;胆碱处理细胞后，细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸水平显著降低;TMA处理细胞后，细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸和葡萄糖水平显著降低;TMAO处理细胞后、细胞体内甘油三酯水平显著降低。本研究中的处理化合物对细胞内海藻糖含量均无显著影响。当给果蝇饲料中添加L-肉毒碱后，虫体内甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和葡萄糖水平显著降低;添加饲喂TMA后，虫体内葡萄糖、糖原和海藻糖水平显著降低;添加饲喂TMAO后，虫体内海藻糖水平显著降低。胆碱对以上各指标均无影响。综上所述，芥子碱和肉毒碱能够显著影响果蝇体内糖脂水平。 三、黑腹果蝇FMO的体外表达 利用原核表达系统及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统开展了DmFMO的体外表达研究。原核表达研究中，将FMO基因重组到pET32a和pET30a载体上，蛋白均以包涵体的形式存在，优化表达条件，仍不能解决蛋白不可溶问题，换用pColdTM-TF载体后可以获得可溶蛋白，但应用TNB/DTNB法未测出酶活性，原核外源表达酶不具有活性。换用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统后，表达得到的重组蛋白同样存在溶解问题。综上所述，DmFMO蛋白虽然可以成功进行体外表达，但存在蛋白可溶性低及蛋白不具有活性的难题。
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