摘要
锰是植物生长发育过程中不可缺少的微量营养元素，参与植物体内多种重要的代谢过程，比如光合作用、蛋白质和脂质的合成、调节多种酶的活性以及氧化胁迫等。在碱性土壤中，锰的有效性降低，因此，锰缺乏是碱性土壤中影响作物产量的一个重要限制因子。研究表明，拟南芥中NRAMP1是一个高亲和的锰转运蛋白，在低锰条件下参与锰的吸收。深入研究植物对锰的利用机制，对于改善植物在缺锰环境下的营养状况具有重要的指导意义。本论文通过对拟南芥锰转运突变体nr amp1诱变体库的筛选，得到一个锰依赖的新叶黄化突变体mdg10nramp1(mdg10，Mn-dependent defective growth10)。以该突变体为研究对象进行相关的生理袁型分析、遗传分析以及对目的基因的克隆和功能分析。除此之外，锰转运蛋白也参与对镉的吸收和转运，土壤镉污染会导致稻米镉积累严重超标。敲除水稻中的镉转运蛋白是减少籽粒中镉积累的有效途径。水稻根系的镉吸收主要由锰转运蛋白OsNRAMP5来完成，目前，敲除OsNRAMP基因能否在降低水稻镉积累的同时又不影响其生长和产量仍不明确。所以，本研究利用CRISPR/Cas9技术对江苏省2个主要栽培品种南粳46和淮稻5号中的OsNRAMP5基因进行定向敲除，并对敲除材料进行相关的试验分析，希望能够创制新的水稻低镉品系。具体试验结果如下: (1)在缺锰条件下，mdg10nramp1出现新叶黄化表型，新叶的叶绿素含量显著下降。通过添加足量锰，突变体缺锰表型能够完全恢复。mdg10nramp1在缺铁，缺锌以及加镉处理条件下，表型与nr amp1均无明显差异，说明该突变体特异响应低锰。元素含量测定结果显示，在缺锰情况下，mdg10nramp1的新叶及其叶绿体中的锰含量均显著下降。推测，mdg10nram1中锰的再利用存在缺陷。通过全基因组混池测序并结合遗传连锁分析，最终克隆了MDG10。该基因编码一个外显子连接复合物(Exon junction complex，EJC)的重要组分。据报道，EJC在无义介导mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay，NMD)过程中发挥作用，参与mRNA的剪接、转运和翻译。在动物中有相关报道其能与真核起始因子(eukaryotic initiation factor3，eIF3)直接互作并激活翻译过程。MDG10在根、叶、茎、花和果荚中都有表达，在WT背景下不受锰诱导，但在nramp1背景中受缺锰诱导。亚细胞定位显示其定位在细胞质和细胞核中。 (2)利用CRISPR/Cas9技术分别对2个粳稻品种中的OsNRAMP5基因进行定向敲除，得到3个独立的无转基因标签的纯合功能缺失突变体。在低锰培养条件下，osnramp5植株的生长势和叶绿素含量均显著低于野生型;通过添加足量锰能够充分恢复该突变体的生长缺陷袁型。镉和锰在突变体地上和地下部的积累量相比野生型都显著减少。田间试验结果显示，突变体剑叶和籽粒中镉的含量显著减少，但是一些农艺性状如株高、结实率、每穗穗粒数等均受到不同程度的影响，最终导致产量轻度下降。推测突变体中锰含量的显著减少导致植株生长受限。所以，建议在运用osnramp5来降低稻米镉积累的同时，还需要考虑稻田土壤的pH以及水分的含量。 综上所述:1、在缺锰条件下，mdg10nramp1新叶及其叶绿体中的锰含量显著下降，推测可能是因为MDG10突变之后导致了一些锰转运蛋白的RNA剪切、加工和运输不能顺利完成。2、利用CRISPR/Cas9技术敲除OsNRAMP5基因能够显著减少籽粒中的镉浓度，但同时锰积累也显著减少，影响了突变体的生长和产量。
NETL