烟碱降解细菌根癌农杆菌LN-1（Agrobacterium tumefaciens LN-1）的筛选、鉴定及其降解特性研究

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中文摘要：烟碱是烟草等植物体内的主要生物碱成分，同时，也是一种毒性物质，会使人产生依赖性，对环境造成不可逆的影响。通过微生物降解烟碱是一种低成本、高效率、无二次污染的方法，因此生物降解烟碱技术对降低烟碱含量、减少烟碱污染、提高烟草废弃物利用率、保护水资源与生态环境等方面都具有重要意义。本研究从河南省洛宁县罗岭乡长期植烟土壤出发，旨在筛选分离出可高效降解烟碱的细菌，对其降解特性及降解产物进行探究;同时运用全基因组测序技术及生物信息学等分析方法，了解相关降解基因，并推测其降解途径，以期为烟碱降解乃至环境污染治理提供新的微生物资源。主要研究结果如下: 1、本研究从河南省洛宁县罗岭乡长期植烟土壤取样，经筛选、分离、鉴定出一株可高效降解烟碱的细菌。根据该菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列比对分析，将菌株鉴定为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），并命名为Agrobacterium tumefaciens LN-1。 2、通过高效液相色谱法(HPLC)对不同降解时间下根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LN-1的发酵液进行研究，发现16h时于4.51和5.72min处产生新峰，说明烟碱降解并产生中间产物;20h烟碱吸收峰继续降低，新峰面积较16h略有增加;28h烟碱吸收峰明显降低，新峰面积明显增加，说明烟碱降解过程中的中间产物在不断积累;30h烟碱吸收峰基本消失，新峰面积与28h相比基本无变化，代谢产物含量基本稳定，烟碱降解过程结束。HPLC结果表明Agrobacterium tumefaciens LN-1具有高效的烟碱降解能力，可在30h内完全降解1g/L烟碱，且在降解过程中会产生几种不同的中间代谢产物。通过绘制生长-降解曲线，发现菌株Agrobacterium tumefaciens LN-1的生长与烟碱的降解具有同步性，即通过分解代谢烟碱获取供给自身生长所需的碳氮源及能源。 3、利用高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)在Agrobacterium tumefaciens LN-1降解烟碱的发酵液中共检测到三种中间代谢产物，分别是6-羟基-3-琥珀酰吡啶(6-Hydroxy-3-Succinoyl-Pyridine，HSP)、6-羟基烟碱(6-Hydroxynicotine，6HN)和3-琥珀酰吡啶(3-Succinoyl-Pyridine,SP)。 4、本研究采用三代测序PacBio RSII平台和BGISEQ-500RS平台对Agrobacterium tumefaciens LN-1进行全基因组测序，并从对该菌株的基因组进行生物信息学分析。结果表明，Agrobacterium tumefaciens LN-1基因组大小为5，586，294bp，GC含量为59.40％，包括一条2，260，658bp的线性染色体、一个2，908，638bp的环状染色体及两个环状质粒分别为233，332bp、183，666bp，这种排布与其他根癌农杆菌相似;基因组含有5404个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，总长度为4，872，984bp，基因组内包含130个重复序列，54个tRNA、4个5SrRNA、4个16SrRNA、4个23SrRNA和33个sRNA;功能注释结果表明这些基因在生物调节、细胞过程、代谢过程、生物学过程调节、细胞结构实体、DNA结合、催化活性、转运蛋白活性、氨基酸的转运与代谢、碳水化合物的转运与代谢、转录和环境信息处理方面的基因较多;此外还发现在Agrobacterium tumefaciens LN-1的线性染色体662，156-693，086bp之间存在一个基因簇，分析其基因注释结果及基因在染色体上的排序发现，该基因簇中包含hsh、pno、hpo、ndhAB等烟碱降解相关的基因，通过分析该基因簇以及相关基因的作用，并结合LC-MS的降解中间产物结果，基本确定Agrobacterium tumefaciens LN-1是通过吡啶与吡咯烷的“交叉途径”(Variants of the pyridine and pyrrolidine pathways，VPP)降解烟碱 5、菌株Agrobacterium tumefaciens LN-1的线性染色体中还存在一个对羟基苯甲酸降解基因簇，该基因簇中包含pca、pob、fad等与对羟基苯甲酸降解相关的基因。推测Agrobacterium tumefaciens LN-1能够降解对羟基苯甲酸。

作者：

张豪洋

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关键词：

烟碱降解细菌根癌农杆菌降解特性全基因组测序生物信息学

授予学位：

硕士

学科专业：

农艺与种业

导师：

许自成；党炳俊

学位年度：

2021

学位授予单位：

河南农业大学

语种：

中文

中图分类号：