摘要
研究目的: 肠上皮是机体抵御外界微生物入侵的重要防线，与之适应其是机体更新最快的组织之一。肠上皮再生依赖于肠干细胞(intestinal stem cell，ISC)自我更新、增殖和分化（谓肠干细胞干性），干细胞功能缺失引起肠上皮修复障碍，过度激活与结直肠肿瘤发生相关。深入了解肠干细胞干性稳态维持机制，有助于明确生理肠上皮稳态的维持机制，并为炎症性肠病、结肠肿瘤等肠道疾病的治疗提供依据，具有重要的理论和临床意义。 死亡受体5(death receptor5，DR5)又称TRAIL-R2(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor2)，是凋亡诱导肿瘤坏死因子受体超家族一员，由于选择性诱导某些肿瘤细胞凋亡而被研究者所关注。近年来研究提示DR5还介导了死亡信号以外的其他作用。DR5在肠上皮细胞表达，生理条件下肠上皮DR5对TRAIL诱导的凋亡存在显著抵抗，提示肠上皮表达的DR5可能存在凋亡以外的其他作用。我们在预实验中发现DR5优势表达在结肠隐窝底部，推测DR5可能参与了肠干细胞干性的生理调节。在本课题中我们设计利用DR5基因缺陷(DR5-/-)小鼠研究结肠隐窝DR5在干细胞干性调节中的作用及其机制，研究结果将为肠干细胞稳态调节机制提供新的实验依据。 研究方法: 1.实验动物分组及处理:6-8周健康雄性成年C57BL/6N小鼠(WT)及DR5基因缺陷(DR5-/-)小鼠，或取结肠制备石蜡切片，进行HE染色、免疫组织化学染色等，或将结肠放入-80℃冰箱冻存进行Western blot或QRT-PCR检测。 2.BMP/Smad通路抑制剂LDN193189处理:雄性C57BL/6N小鼠、DR5基因缺陷小鼠，随机分成WT对照组、DR5基因缺陷小鼠对照组、DR5基因缺陷小鼠+LDN193189处理组（抑制BMP通路靶蛋白Smad1/5/8磷酸化）组。腹腔注射BMP抑制LDN193189(3mg/kg)，对照组注射同等剂量生理盐水，注射后12小时牺牲动物，取结肠制备石蜡切片，进行HE染色、免疫组织化学染色，或取结肠组织放入-80℃冰箱冻存进行Western blot或QRT-PCR检测。 3.溃疡性结肠炎(UC)模型:C57BL/6N雄鼠、DR5基因缺陷雄鼠(6-8周)给含1.5％DSS饮用水连续7天，或2.5％DSS的饮用水连续6天，每天记录小鼠体重、粪便形状、隐血或者便血情况。6/7天后牺牲动物，取结肠制备石蜡切片，进行HE染色、免疫组织化学染色，或放入-80℃冰箱冻存以备Western blot检测。 4.离体细胞培养:人正常结肠上皮细胞系CCD841细胞，在含有10％胎牛血清、1％青链霉素（100μg/ml）的DMEM培养基培养，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。加DR5选择性激动剂Bioymifi(10-8M、10-7M、10-6M、10-5M、2×10-5M、5×10-5M)刺激CCD841细胞，收集细胞进行细胞活力检测（Cell Counting Kit-8，CCK8）流式细胞周期检测或Western blot检测。 研究内容: 1.在体实验:HE染色检测结肠隐窝深度;PAS(Periodic Acid-schiffstain)糖原染色检测杯状细胞数目。QRT-PCR:检测肠干细胞标记基因Lgr5，Olfm4、Ascl2表达;杯状细胞标记基因MUC2、TFF3(Trefoil factor3)表达;杯状细胞分化相关基因Klf4、Elf3表达;肠上皮细胞标记基因ALPI表达;BMP信号通路配体BMP2、BMP4、BMP7表达;BMP信号通路下游靶基因ID1、ID3表达;Wnt通路配体Wnt3、下游核心效应分子β-catenin、下游靶基因c-myc表达;Notch通路配体DLL1、DLL4、下游靶基因Hes1表达。Western blot:检测结肠组织DR5、干细胞标记物Lgr5、肠上皮分化关键因子CDX2、BMP信号途径下游靶蛋白p-Smad1/5表达、BMP信号通路配体BMP4表达;炎性介质iNOS的表达。 2.溃疡性结肠炎(UC)模型:每天记录小鼠体重、粪便形状、隐血或者便血情况，进行疾病活性指数评估;取材时记录结肠长度，制备石蜡切片以备组织学检测。 3.离体细胞实验:流式检测细胞周期（DNA含量检测）及CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测Bioymifi对CCD841细胞增殖的影响;Western blot检测Bioymifi处理对细胞干细胞标记物Lgr5及凋亡蛋白Cleaved caspase3、caspase3表达的影响。siRAN干扰CCD841细胞DR5表达，流式细胞仪检测对细胞增殖的影响。 研究结果: 1.结肠上皮细胞表达DR5，在隐窝底部干细胞区DR5在细胞核有显著阳性表达，在向肠腔侧移行过程中核表达逐渐减弱。 2.DR5在结肠干细胞自我更新和增殖中的作用 野生型小鼠和DR5基因缺陷小鼠结肠隐窝深度未见区别;与野生小鼠相比，DR5基因缺陷鼠干细胞标记基因Lgr5、Olfm4、Ascl2表达显著下调，Lgr5蛋白表达下降;DR5基因缺陷小鼠隐窝Ki67阳性细胞数目显著减少。提示DR5基因缺陷引起干细胞自我更新和增殖的抑制。 3.DR5在生理结肠干细胞分化中的作用 与野生鼠相比，DR5基因缺陷小鼠结肠隐窝PAS阳性和MUC-2阳性细胞数目显著增多，杯状细胞标记基因MUC2、TFF3以及杯状细胞分化标记物Klf4、Elf3表达上调;肠上皮标记基因ALPI表达上调，CDX2阳性肠上皮细胞数目及蛋白表达均显著增多。提示DR5基因缺陷引起干细胞向杯状细胞、肠上皮细胞的分化增加。 4.DR5调节肠干细胞干性的可能机制 4.1与在体结果一致，siRNA下调CCD841细胞DR5基因表达引起S期细胞数目显著减少，提示内源性DR5参与细胞增殖调节。不同浓度的选择性DR5小分子激动剂Bioymifi处理CCD841细胞，高浓度（高于2x10-5M）Bioymifi诱导CCD841细胞凋亡，低于该浓度则没有引起细胞凋亡。相应的，未能诱导细胞凋亡的低浓度Bioymifi(10-7M、10-6M)处理细胞后，S期细胞增加，干细胞标记物Lgr5表达上调，提示低浓度可以促进细胞增殖。与野生型小鼠相比，DR5基因缺陷小鼠未发生结肠隐窝细胞凋亡改变，生理条件下结肠隐窝干细胞区核表达DR5未介导死亡信号而是参与了结肠干细胞增殖和分化的调节。 4.2DR5对结肠干细胞干性调控相关通路的影响 与野生小鼠相比，DR5基因缺陷小鼠结肠组织BMP信号途径配体BMP4表达上调，BMP2、BMP7表达未改变，生理未见BMP4表达的结肠隐窝底部在肠上皮细胞出现BMP4高表达;BMP通路下游核心蛋白p-Smad1/5表达上调，BMP通路下游靶基因ID1、ID3表达增加，提示DR5基因缺陷引起结肠BMP/Smad信号通路的异常激活，可能与隐窝底部BMP4的异常表达有关。Wnt通路配体Wnt3、下游核心效应分子β-catenin、靶基因c-myc的表达均未发生改变;Notch信号通路配体DLL1、DLL4表达未发生改变，下游靶基因Hes1表达下调。 4.3BMP信号通路在DR5调节干细胞干性中的核心作用 腹腔注射BMP/Smad通路抑制剂LDN193189，DR5基因缺陷小鼠BMP/Smad通路下游靶基因ID1、ID3表达显著下调，而BMP4表达的上调未受影响，说明LDN193189抑制了DR5基因缺陷小鼠BMP/Smad通路的过度激活。与对照DR5基因缺陷小鼠相比，LDN193189处理后的DR5基因缺陷小鼠隐窝Ki67阳性细胞数目明显增多，处理后DR5基因缺陷小鼠隐窝增殖细胞数目与野生鼠之间无统计学差异。LDN193189处理后的DR5基因缺陷小鼠杯状细胞标记基因MUC2、TFF3表达降低、杯状细胞数目显著减少，与野生鼠之间无统计学差异。经LDN193189处理后DR5基因缺陷小鼠Notch信号通路靶基因Hes1表达的改变被逆转，与野生型小鼠无差异。研究提示阻断BMP通路逆转了DR5基因缺陷引起的干细胞干性的改变。 5.DR5在溃疡性结肠炎(UC)中的作用 与野生型小鼠结肠炎模型相比，DR5基因缺陷小鼠DSS模型死亡率显著增加，其体重下降幅度、疾病活性指数、结肠上皮损伤评分、隐窝损伤评分及炎性介质iNOS的分泌与野生型小鼠相比都明显增加。 研究结论: 1.结肠上皮细胞表达DR5，DR5在隐窝底部干细胞区优势表达。 2.结肠上皮DR5基因缺陷抑制结肠干细胞自我更新、增殖，促进干细胞向杯状细胞、肠上皮细胞的分化。 3.DR5基因缺陷对干细胞干性的影响与隐窝细胞BMP4/Smad信号通路的激活有关，DR5对隐窝底部低BMP4/Smad信号梯度的维持必不可少，DR5对隐窝底部肠干细胞自我更新、增殖和低分化状态的维持具有重要意义。 4.DR5基因缺陷小鼠对DSS诱导的结肠炎更为易感，可能与其激活BMP4/Smad信号通路，抑制干细胞自我更新和增殖有关。
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