摘要
果蔬灰霉病是世界级毁灭性植物病害之一，其发病原因主要是由于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的侵染所导致的。目前，化学防治是灰葡萄孢菌防治过程中最常用的手段。但化学制剂的残留会对人体造成毒害，并且关于化学制剂抗灰葡萄孢菌机理的研究较少，这在一定程度上限制了新型抗真菌药物的研究和开发。研究表明，甾醇14α-去甲基化酶（Sterol14α-demethylase，CYP51）是灰葡萄孢菌细胞膜上麦角甾醇合成过程中的重要蛋白，通过干扰CYP51的产生破坏细胞膜结构，导致真菌细胞的损伤。基于以上研究，本文利用虚拟筛选的方法发现了抗灰葡萄孢菌CYP51的小分子天然化合物桑黄酮，结合计算生物学以及体外实验等方法对其作用机制、抑菌效果以及实际应用进行分析研究，以期为新型靶向灰葡萄孢菌CYP51抑菌剂的开发提供新的研究思路和研究基础。 （1）抗灰葡萄孢菌CYP51抑制剂的筛选 通过I-TASSER20软件构建了灰葡萄孢菌CYP51的3D结构并进行了1000ns的分子动力学模拟以获得稳定的蛋白结构。接下来，以CYP51为靶标蛋白对ZNIC数据库进行虚拟筛选，对筛选得到的50种小分子天然化合物进行抑制活性的测定。最终得到桑黄酮、(s)-异补骨脂二氢黄酮、异黄腐醇和桑色素四种小分子化合物，它们对CYP51活性抑制的IC50值分别为：1.480μΜ、3.872μΜ、86.070μΜ和150.410μΜ。其中，桑黄酮对CYP51的抑制活性优于其他三种化合物。 （2）桑黄酮与灰葡萄孢菌CYP51的作用机制研究 为了探究四种化合物抑制活性存在差异的原因，通过分子对接、分子动力学模拟以及结合自由能计算等方法探究了四种小分子化合物与CYP51的相互作用机制。结果表明，四种小分子化合物均能结合在CYP51中以血红素Fe离子为活性中心的活性区域。但只有桑黄酮可以通过自身结构C9原子处的2-甲基戊-2-烯基团与CYP51活性中心的Fe离子形成π-阳离子相互作用，这是典型的竞争性抑制；并且与氨基酸残基TYR-113之间存在很强的π-π相互作用；还与氨基酸残基LEU-116和LEU-498具有更近距离，从而导致了强烈的疏水相互作用。此外，在结合自由能的计算中桑黄酮复合体系也显示出了比其他三种复合物体系更强的总结合自由能。进一步表明桑黄酮C9原子处的2-甲基戊-2-烯基团是CYP51抑制剂的关键药效团，更好的解释了桑黄酮对CYP51抑制活性最为优异的原因。因此，选择桑黄酮作为研究对象进行后续实验。 （3）桑黄酮对灰葡萄孢菌的抑菌保鲜效果研究 利用最小抑菌浓度及菌丝生长和孢子萌发实验测得桑黄酮对灰葡萄孢菌的最小抑制浓度为32μg/mL，对菌丝生长及孢子萌发的IC50值分别为：21.049和9.480μg/mL。抑菌圈实验表明当桑黄酮浓度为32μg/mL时，对灰葡萄孢菌已达到高敏感抑制。通过观察菌丝及其超微结构发现，经桑黄酮处理后，菌丝缩短，表面出现沟壑。随着桑黄酮浓度的增加，菌丝体缩短并逐渐聚集。细胞膜从细胞壁脱离，破裂并发生溶质。同时，细胞内成分严重受损，表明桑黄酮对灰葡萄孢菌的细胞结构造成了一定的破坏。荧光染色实验表明，桑黄酮处理可以破坏灰葡萄孢菌的细胞膜，导致细胞质渗出、细胞内活性氧水平增加、对菌丝体造成氧化应激，进而对灰葡萄孢菌产生了抑制作用。最后，利用灰葡萄孢菌感染模型探究桑黄酮的实际抑菌保鲜效果。结果表明，桑黄酮处理可以延缓草莓中灰葡萄孢菌的产生，并且对草莓感官品质、软化腐烂率、失重率、色度、硬度和pH值等理化性质都具有十分积极的影响。与BK组和1%柠檬酸水溶液组相比，16μg/mL桑黄酮组和32μg/mL桑黄酮组可将草莓的贮藏期分别延长至第6天和第9天，可作为潜在的天然防腐剂进行果蔬保鲜。 综上所述，本研究以灰葡萄孢菌CYP51为靶标，结合计算生物学的方法，发现了新型靶向CYP51小分子天然化合物桑黄酮，并在原子水平上揭示了桑黄酮与CYP51的作用机制。然后，将桑黄酮应用到灰葡萄孢菌感染模型中并探究了实际抑菌保鲜效果，为新型果蔬保鲜剂的开发提供了新的研究思路和理论基础。
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