摘要
机体在与病原体长期抗感染与感染的博弈中，伴随着遗传进化逐渐形成一种先天性的阻止外来微生物或病原体入侵的免疫防御能力，这种先天性免疫系统被称为天然免疫。作为机体抵御外源病原微生物的第一道防线，其具有非特异性、广谱性、快速反应性及遗传性的特点。其中Ⅰ型干扰素(typeⅠInterferon，IFN-Ⅰ)信号通路是天然免疫过程中发挥重要作用的一环。病原体及微生物入侵机体细胞内后，胞内模式识别受体可以识别到病原体及其产物并被激活，通过级联放大反应活化其所介导的下游信号通路并产生干扰素，继而激活Jak-STAT信号通路产生一系列干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs），直接或间接的介导病原体清除并维持免疫平衡。 冠状病毒(Coronavirus，CoVs)广泛存在于自然界中，宿主范围广泛，常见感染人类、哺乳动物及禽类。近年来，SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的相继爆发严重影响到人类的生命安全和社会经济的正常发展秩序，引起人们对冠状病毒的高度关注。与此同时，猪肠道冠状病毒TGEV、PEDV、PDCoV和SADS-CoV在猪群中传播迅速，致死率高，对全球生猪养殖业造成重创，这使得全面剖析其病毒-宿主的相互作用及其分子机制等科学问题亟待解决。本研究以SADS-CoV的NS7a蛋白为研究对象，旨在研究NS7a在Ⅰ型干扰素信号通路应答过程中所发挥的作用及潜在调控机制。 为了探究NS7a在病毒诱导激活的Ⅰ型干扰素信号通路中的作用，本研究采用病毒类似物poly(I∶C)(Polyinosinic-polycytidylic acid)诱导活化HEK293T细胞中IFNβ、ISRE(Interferon-stimulated response elements)、IRF3(Interferon regulatory factor3)、NF-κB(Nuclear factor-κB)的启动子活性及干扰素信号通路，并采用双荧光报告基因系统、实时荧光定量PCR分析NS7a对上述启动子活性剂信号通路相关信号分子的mRNA水平的影响;此外，利用蛋白质免疫印记评价NS7a对poly(I∶C)所诱导的信号通路信号分子蛋白表达水平的影响。结果显示，NS7a显著抑制IFNβ、ISRE和NF-κB的启动子水平;此外，NS7a同样显著地抑制信号通路下游效应分子DDX58、MDA5、IRF3、TBK1、STING，STAT2、OASL、ISG15和IFIT2的mRNA转录水平。免疫印迹分析结果显示，NS7a同样显著抑制Ⅰ型干扰素相关分子的蛋白表达，使TBK1、P-TBK1、STING、P-STING、IRF3、P-IRF3、STAT1、P-STAT1、P-STAT2及IRF9的蛋白水平显著下调。 为寻找NS7a在IFN-Ⅰ信号通路中可能的作用靶点，结合前期数据，本研究首先构建了IFN-Ⅰ通路各分子的真核表达质粒，重点分析信号通路上游分子与NS7a的蛋白互作。co-IP结果显示，NS7a并未与IFN-Ⅰ通路上游分子产生直接相互作用。但试验过程中的另一现象引起我们的注意，即NS7a可使HEK293T细胞形态异常、死亡增加，该现象提示:NS7a可能诱导细胞凋亡。为证实这一猜想，本研究采用镜下形态学观察、蛋白质免疫印记和流式细胞术等经典凋亡检测方法，验证发现NS7a在转染48h后不仅可以显著抑制干扰素信号通路，也可以有效诱导HEK293T细胞发生凋亡，在NS7a转染细胞44h后，细胞发生晚期凋亡占比约12％，早期凋亡占比约40％。内源性co-IP结果显示，NS7a与caspase-8酶原存在相互作用。进一步研究发现Z-VAD无法抑制NS7a引起的HEK293T细胞凋亡。 综上所述，本研究发现SADS-CoV的NS7a蛋白可以抑制由poly(I∶C)刺激激活的Ⅰ型干扰素信号通路并诱导HEK293T细胞发生凋亡，推测NS7a可能通过与caspase-8相互作用，激活外源性凋亡通路从而导致HEK293T细胞发生凋亡。
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