摘要
聚酮类(PKs)及非核糖体肽类(NRPs)天然产物是至关重要的药物备选库。当今，通过组合生物合成手段操纵天然产物的生物合成途径，如基因或结构域的插入、删除、替换等，对天然产物进行理性的修饰，从而获得衍生产物的方法已经成为药物开发的重要手段之一。通过组合生物合成手段不仅能极大扩充相关天然产物的多样性，而且能定向改造其活性官能团，获得优质的备选药物。其突破了化学合成或修饰过程中的官能团限制，是对化合物进行全面改造的合理手段。目前，人们在非核糖体肽的组合生物合成方面取得了较好的进展，但针对非核糖体脂肽的组合生物合成研究却较少，究其原因是这类天然产物脂酰基链的特异性控制机制和起始过程还未被阐明。因此，尝试阐明脂肽的脂酰基起始过程，并以此为基础对其进行理性的改造是较为合理的组合生物合成策略。对于聚酮类天然产物而言，当前的组合生物合成研究主要集中在cis-AT PKS指导合成的聚酮类天然产物上，针对trans-AT PKS指导合成的聚酮类天然产物的研究较少，因此对trans-AT PKS指导合成的聚酮进行系统的组合生物合成研究或能推进这类化合物组合生物合成的发展，为其组合生物合成规律的研究提供新的思路，提高其成药的可能性。 1.伯克氏菌中非核糖体脂肽的脂酰基团改造 rhizomide与holrhizin是伯克氏菌DSM19002产生的两类非核糖体脂肽类天然产物，其产物中都含有一个脂酰基团，也叫脂链或脂酰基链。起始合成时，由一个起始的缩合结构域(Starter Condensation domain，Cs domain)负责将脂链整合到下游的氨基酸骨架上。研究表明，脂肽类天然产物的脂链结构对其活性至关重要，然而迄今为止，Cs结构域对脂酰基底物的特异性识别机制仍未阐明，阻碍了相关的组合生物合成研究。因此，若能阐明Cs结构域对脂酰基底物的特异性控制机制，则能对脂肽类产物的改造形成有效的指导。以此为基础，对脂肽进行理性的组合生物合成，定向改造其脂酰基团，从而获得具有高效活性的衍生产物，提高其成药属性或产量。 本研究首先利用Red/ET同源重组技术，一步直接克隆获得了rhizomide（rzmA）和holrhizin（holA）的生物合成基因簇，分别对其进行转座元件插入及组成型启动子替换修饰后，转入伯克氏菌目DSM7029中并成功异源表达。随后利用点突变、模块交换、同源修饰等组合生物合成手段对rzmA及holA基因簇进行了遗传改造，并成功获得了活性提升的改造产物，包括C8-RzmA，C10-RzmA，C12-RzmA，C14-RzmA以及C16-RzmA等。 我们利用已报道的晶体结构对rhizomide或holrhizin的Cs结构域进行了同源建模分析，筛选得到了Cs结构域中决定其脂链特异性的第一个关键氨基酸位点（对于rzmA的Cs结构域而言为:R148），推测其位于脂酰基底物结合口袋的入口位置，并通过体内全长基因簇点突变和体外酶学实验验证了其关键作用。随后，我们对rhizomide的Cs结构域(RzmA-Cs)进行了晶体结构分析，包括RzmA-Cs未结合底物的形式、脂酰基底物结合的形式、脂酰基和氨酰基底物的三元复合物。RzmA-Cs与脂酰基底物的共结晶结构表明，五个氨基酸在脂酰基底物特异性识别中起着关键作用，第一个关键氨基酸R148，位于脂酰基底物结合口袋的入口位置，四个氨基酸Q36/Q136/Y138/M143位于口袋内部，其中Q36和Y138起决定性作用，Q136和M143起次要作用。进一步通过体内全长基因簇点突变和体外酶学研究，最终成功实现了将rzmA基因簇的产物rhizomide A由C2脂酰基长度改造为C16脂酰基长度。结合RzmA-Cs的多个晶体结构进行分析，进一步阐释了其脂链的起始过程，构建了由“底物未结合态(Unbound)”-“与氨酰基及脂酰基底物的三元复合态(Bound)”-“产物的释放态(Release)”的反应循环。与此同时，我们也探索了利用Cs结构域交换的方法改造其脂酰基链，如rhizomide的Cs全长与holrhizin的Cs结构域全长进行交换，成功获得了交换产物，并结合体外酶学实验和晶体结构进一步挖掘了此方法的普适性潜力，在其他工作中也得到了进一步应用。 综上所述，我们成功对rhizomide和holrhizin这两类脂肽进行异源表达，并建立了两种定向改造脂肽类天然产物脂链的方法:1）通过对起始缩合结构域（Cs结构域）中决定脂酰基链特异性的关键氨基酸位点进行定点突变，定向改造脂肽。2）对Cs结构域进行全长交换，定向改造脂肽。我们首次获得了Cs结构域与相关脂酰基底物的共结晶结构，初次明确了Cs结构域中决定脂链特异性的关键位点，基本阐明了其底物特异性控制机制及催化过程。利用这些关键氨基酸数据建立的点突变方法可与Cs结构域全长交换的方法互为补充，以上两种新方法将为脂肽的定向改造及成药提供积极的促进作用。与全长结构域交换相比，点突变的方法不仅在结构上对Cs结构域的侵入较少，而且无需引入外来结构域，不受限于种属差别;全长Cs结构域交换则在产量上占优势，其可能更适用于同种属。以上晶体结构的阐明及相应定向改造方法的确立或对潜力脂肽或药物的改造提供极大的借鉴意义。 2.rhizoxin的异源表达及组合生物合成研究 聚酮类天然产物是药物的重要来源之一，由聚酮合酶(PKS)催化合成，主要分为三型，其中Ⅰ型PKS由非重复使用的模块构成，每个模块一般由三个基本的结构域组成，包括酮基合成酶结构域(KS)、酰基转移酶结构域(AT)、以及酰基载体蛋白结构域(ACP)。其中还包含一个或多个修饰结构域，如酮基还原酶构域(KR)、脱水酶结构域(DH)以及碳甲基转移酶结构域(cMT)等。线性化分布的结构域催化碳单位的逐步延伸，终产物最终由硫酯酶结构域(TE)负责释放。反式酰基转移酶类的聚酮合酶（trans-AT PKS）是Ⅰ型模块化聚酮合酶中非常重要的一类，其核心基因簇都由独立的酰基转移酶结构域(AT)负责整个产物的酰基转移。与顺式酰基转移酶酶类的聚酮合酶(cis-ATPKS)不同，其模块间的进化关系相对独立，且经常含有较为特殊的结构域或模块，如含有NRPS功能域。目前针对trans-AT PKS的组合生物合成研究较少。rhizoxin是伯克氏菌DSM19002中的一类由杂合的非核糖体肽酶/聚酮合酶(NRPS/trans-AT PKS)合成的聚酮类化合物，其能抑制微管的聚合，具有抗肿瘤潜力。但因其结构的不稳定性，较大的细胞毒性而止步于Ⅱ期临床。本研究尝试通过组合生物合成手段对其进行改造，以降低其生物毒性，提高其稳定性，并借此探索trans-AT PKS类天然产物的组合生物合成规律，为后续类似簇的修饰提供借鉴。 本研究首先利用Red/ET同源重组技术，直接克隆获得了rhizoxin（rhi）的生物合成基因簇，插入转座元件后，转入伯克氏菌目DSM7029中并成功异源表达，随后利用点突变和模块替换两种组合生物合成方法对其进行改造研究。1）利用点突变方法对11个KR结构域、8个DH结构域以及5个MT结构域进行了系统性的失活，成功获得了MT1及MT3相应位置不带甲基的衍生产物，证明了在trans-AT PKS中MT是合适的改造对象。其余的MT以及所有的DH和KR的突变均未获得预期的衍生产物，反而产生了意料之外的分子量或产量降低的原始产物。一方面，这可能说明反式酰基转移酶类的聚酮合酶其上下游结构域，如KS结构域，KR、DH结构域等对中间产物识别的特异性较强，因此不是合适的改造对象。另一方面，也说明了功能相同的结构域之间存在差异，其活性中心的重要性可能需要进一步细化。2）使用模块交换的方法，以埃博霉素(epothilone)的NRPS区域为供体，替换了rhizoxin的NRPS区域（受体），成功获得了噁唑环改变为噻唑环的衍生产物。并进一步通过不同位置的交换探索了合适的融合位点，即在NRPS功能域的替换过程中，最优的选择是将其原始的ACP/PCP与临近结构域作为一个功能域进行置换，并保留受体临近KS的linker。 综上所述，我们探索了trans-AT PKS指导合成的天然产物rhizoxin的组合生物合成策略，主要包括1）系统的点突变其修饰结构域，包括KR、DH和MT，最终证实MT是trans-AT PKS中成功率较高的改造对象，获得了两个去甲基的新型衍生产物。2）NRPS功能域替换，利用cis-AT PKS指导合成的天然产物埃博霉素中的NRPS功能域替换了rhizoxin的NRPS功能域，成功将rhizoxin的噁唑环改造为噻唑环，通过实践证明了trans-AT PKS中的NRPS功能域是合适的改造对象，这是首次将cis-AT PKS的NRPS功能域用于改造trans-AT PKS。并通过实践证明，在功能域替换时应保留供体原始的ACP/PCP及受体临近KS的linker。以上组合生物合成实践初步探索了trans-AT PKS的组合生物合成规律，有助于推动这类重要天然产物组合生物合成的发展。
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