摘要
卵丘细胞的增殖与凋亡对于卵母细胞的成熟以及胚胎的发育至关重要，同时细胞的生长又受到表观遗传修饰的调控。缺失的、小的、同源异形1蛋白(absent，small or homeotic1，ASH1L)是组蛋白赖氨酸甲基转移酶，牛ASH1L基因表达下调能诱导卵丘细胞的凋亡、抑制细胞增殖和H3K36甲基化、降低体外受精胚胎的发育，但其中的作用机制还不清楚。本文通过RNA-seq预测牛ASH1L的靶基因，并研究其可能的靶基因在牛卵丘细胞的表达和功能，为揭示ASH1L甲基转移酶及其靶基因对家畜胚胎发育的调控机制提供理论依据。 试验一:为筛选组蛋白赖氨酸甲基转移酶ASH1L的靶基因，揭示ASH1L在卵丘细胞增殖、卵母细胞成熟和胚胎发育中的作用机制。本研究采用siRNA技术干扰牛卵丘细胞中ASH1L基因的表达，收集细胞进行转录组测序和生物信息学分析。结果显示，干扰组与对照组细胞共筛选出2046个差异表达基因，主要富集到2802个GO条目，如细胞分裂、细胞连接和组蛋白甲基转移酶活性;涉及白细胞跨内皮迁移、PI3K-Akt、细胞粘附等53条KEGG通路。基因集富集分析结果显示，ASH1L基因参与发育诱导、H3K4特异性组蛋白甲基转移酶活性、组蛋白去甲基化等生物学过程。另外，两组细胞的mRNA存在了12种可变剪切方式，共117993个可变剪切事件;还检测到522205个SNP位点，碱基转换的发生频率显著高于颠换。根据GO富集分析和KEGG富集分析，预测ASH1L的靶基因为BMP4和CLDN6。 试验二:为探究BMP4在牛卵丘细胞中的表达和功能，首先检测BMP4基因在卵丘细胞中的mRNA表达水平和亚细胞定位，然后研究BMP4表达下调对细胞凋亡、细胞周期和增殖的影响。结果显示，BMP4在牛卵丘细胞中有表达，且定位于细胞质中。干扰BMP4基因后，细胞凋亡率显著增加，促凋亡基因BAX和CASPASE-3表达水平显著上调，抗凋亡基因BCL-2表达水平显著下调(P＜0.05)。同时，BMP4基因表达下调导致细胞增殖率显著下降，细胞增殖相关基因PCNA、CDC42和CCND2表达量显著降低（P＜0.05）;干扰BMP4基因表达引起处于G0/G1期的卵丘细胞比例显著升高，而S期的卵丘细胞比例显著降低(P＜0.05)。另外，BMP4基因表达下调，TGF-β通路相关基因SMAD6、NOG和INHBA的mRNA表达量显著降低(P＜0.05)。可见，BMP4基因能够调控卵丘细胞的增殖和凋亡。 试验三:为探究CLDN6在牛卵丘细胞中的表达和功能，采用荧光定量PCR方法检测到其mRNA在牛卵丘细胞中表达。干扰CLDN6基因表达后，细胞的凋亡率显著降低，促凋亡基因BAX和CASPASE-3表达水平显著下调，抗凋亡基因BCL-2表达水平显著上调（P＜0.05）。同时，CLDN6基因表达下调导致细胞增殖率、增殖相关基因PCNA、CDC42和CCND2表达量均显著升高(P＜0.05);干扰CLDN6基因表达后，处于S期的卵丘细胞比例显著升高(P＜0.05)。说明CLDN6基因也可调节卵丘细胞的增殖和凋亡。 本文对ASH1L基因干扰和野生型卵丘细胞的表达谱进行分析，预测ASH1L甲基转移酶的靶基因为BMP4和CLDN6，并揭示了BMP4和CLDN6基因在牛卵丘细胞增殖和凋亡中的功能和作用机制，进一步阐明ASH1L甲基转移酶对家畜胚胎发育的调控机制。
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