摘要
湖羊是我国一个地方绵羊品种，具有成熟早、四季发情、产羔数多、泌乳性能好和生长发育快等特点。研究其多胎性状的相关长链非编码RNA(lncRNA)和基因具有重要意义。迄今为止，在一些绵羊品种中发现了骨形态发生蛋白1B(BMP1B/FecB)、骨形态发生蛋白15(BMPR-15/FecX)和生长分化因子9(GDF9/FecG)等的突变，这些基因的突变可以影响卵泡发育和排卵，但其潜在的遗传机制仍不清楚。而FecB被认为是与绵羊多胎性相关的首要基因，是控制绵羊繁殖性能关键候选基因。研究表明，FecB基因与湖羊产仔数密切相关，在湖羊上FecB等位基因的频率高达53％。近年来lncRNAs备受关注，研究发现lncRNA参与调控性腺功能、性别决定、性激素分泌、减数分裂、精子发生和胎盘形成等。在下丘脑-垂体-性腺轴(HPOA)中垂体既可以受下丘脑的调节，还可以通过激素和其他调节因子影响卵巢功能，这些调节因子在HPOA上起着重要作用。当垂体发生异常的基因修饰时，它们可能通过HPOA影响家畜的生殖能力。并且以往对繁殖的研究主要集中在不同繁殖力绵羊的卵巢卵泡发生和排卵，极少对垂体中表达的lncRNAs进行系统分析。因此，本研究基于湖羊FecB基因分型和产羔记录筛选出不同繁殖力湖羊垂体作为试验材料，进行测序分析。丰富了绵羊垂体中的lncRNA信息，并在转录组水平上提供了可能调节绵羊多胎的候选分子。 试验一、高低繁殖力潮羊垂体lncRNA和mRNA测序研究 本试验基于FecB基因分型，分析不同繁殖力湖羊垂体中lncRNA和mRNA的差异表达谱，并对差异基因和差异lncRNA靶基因在COG、GO和KEGG进行功能聚类，筛选可能影响湖羊繁殖力的LncRNA和基因。首先根据产羔记录挑选连续三胎每胎产三羔和每胎产单羔的湖羊，通过FecB基因型鉴定筛选出产三羔BB基因型和产单羔B+基因型体况一致的湖羊各3只。同期发情处理后屠宰采集垂体组织，高通量测序结果表明高低繁湖羊垂体组织中存在298个差异表达的mRNA(DE-mRNAs)和57个差异表达的lncRNA(DE-lncRNAs)。对DE-mRNAs和DE-lncRNAs的靶基因进行COG功能注释，功能性的分为17个和11个分类。利用GO富集筛选出与湖羊繁殖力相关GO条目，前20个富集度最高的GO术语包括单组织细胞-细胞粘附、RNA依赖性DNA复制、细胞呼吸和精胺生物合成过程等。此外，与垂体功能和生殖相关的一些GO术语也被富集，包括生殖、生殖过程、对刺激的反应和突触等。KEGG通路富集分析，发现与垂体功能和生殖相关的途径包括cAMP、NF-kappaB、TGF-β、PI3K-Akt、MAPK、hippo、cGMP-PKG和mTOR信号途径，以及催产素、促性腺激素释放激素和胰岛素信号途径。随机选取6个DE-mRNA和6个DE-lncRNA，qRT-PCR验证其表达差异与测序结果一致。 试验二、高低繁殖力湖羊垂体lncRNA和mRNA互作分析及关键基因的研究 LncRNA被认为是与绵羊产羔性能相关的HPOA的重要调节分子。然而，它们在垂体中的表达模式和潜在作用尚不清楚。为了进一步分析和筛选调控绵羊多胎性相关基因表达的潜在lncRNA和mRNA，根据试验一COG、GO和KEGG富集和表达量结果的筛选，共有66个下调和18个上调基因构建了差异基因互作关系;20个lncRNA和36个对应的靶基因构建了lncRNA与靶基因的顺式和反式作用图。通过深入分析lncRNA-靶基因-DE-mRNA三者之间的关系，构建了可能影响繁殖的lncRNA-靶基因-DE-mRNA网络图。进一步选出的2个候选lncRNA及其4个靶基因SMAD2、VMAC、RANBP3和NDUFA11，定量结果显示在高低繁殖力湖羊垂体组织中呈现一定表达趋势。SMAD2基因和其lncRNA MSTRG259847.2在各个组织均有表达，且在垂体组织中表达较高。通过比对SMAD2基因的mRNA和蛋白序列，构建进化树发现其在不同物种保守性较高。高繁殖力组SMAD2蛋白表达高于低繁殖力组(P＜0.05)。其上游基因TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βR1和TGF-βR2表达高繁殖力组高于低繁殖力组(P＜0.05)的表达。本试验表明lncRNA.MSTRG259847.2及其预测靶基因SMAD2可能在湖羊高繁发生机制中具有重要作用。 试验三、LncRNA MSTRG.259847.2在湖羊体外垂体细胞中的作用研究 本试验旨在对lncRNA MSTRG.259847.2及预测靶基因SMAD2进行体外验证，揭示lncRNA MSTRG.259748.2与SMAD2之间的靶向调控关系，并分析其对垂体细胞生殖激素分泌功能的影响。首先对湖羊垂体细胞进行分离并鉴定，通过对lncRNAMSTRG.259847.2进行干扰，检测其预测靶基因SMAD2表达变化。结果表明，在湖羊垂体细胞(Pituitary cells，PCs)进行lncRNA干扰后，SMAD2表达水平也降低。接着，检测了干扰后垂体细胞激素分泌基因的表达，以及干扰24后细胞培养中激素的浓度变化。通过干扰lncRNA MSTRG.259847.2LH基因的表达干扰组较NC组显著降低(P＜0.05),LH激素浓度也显著降低(P＜0.05)。而FSH基因的表达干扰组较NC组相比降低(P＞0.05)，但FSH激素浓度显著降低(P＜0.05)。此外通过检测与细胞凋亡相关基因的变化，发现与细胞凋亡相关的Bcl2、caspase3和caspase9干扰组与NC组相比无显著变化(P＞0.05)。因此，本试验初步证明lncRNA MSTRG.259847.2与SMAD2之间可能存在靶向调控关系，并且lncRNA MSTRG.259847.2可能通过调控SMAD2基因的表达从而影响垂体细胞的激素分泌。
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