摘要
瘤胃作为反刍动物特有的消化器官，其发育状态直接影响反刍动物生产性能和健康。而新生犊牛和羔羊，瘤胃功能发育尚不完善，不能够充分的消化和吸收固体饲料。早期干预幼龄反刍动物的瘤胃发育有利于早期断奶，提高动物的生产性能。因此，在幼龄时期，通过营养手段促进瘤胃的发育和成熟对反刍动物长期的健康和生产性能具有重要意义。 1.口腔灌服丁酸钠对羔羊生长性能、血液指标、瘤胃发酵及上皮形态结构的影响 试验选取7对健康、胎次一致、体重相近的新生双胎湖羊羔羊。在10日龄，将其随机分为两组，一组按1.8ml/kg体重（0.36g/kg体重）口腔灌服丁酸钠(处理组，SB，n=7)，另一组口腔灌服相同体积的生理盐水（对照组，Con，n=7），每天8:00灌服一次，灌服体积根据每周称量的体重调整一次。试验期间在饲喂相同母乳的基础上，自由采食开食料、苜蓿和燕麦草，自由饮水。每周监测羔羊体重变化，每天记录羔羊采食量。在羔羊49日龄颈静脉采血后屠宰采样，采集的血液用于β-羟丁酸，葡萄糖和IGF-1浓度的测定;采集瘤胃液测定瘤胃pH值和挥发性脂肪酸浓度;采集瘤胃上皮组织样品进行瘤胃乳头的形态观察。结果表明:与Con组相比，SB组显著提高了羔羊的平均日采食量(P=0.010)和平均日增重(P=0.022)以及5周龄(P=0.028)和6周龄的体重(P=0.032)，但对2周龄、3周龄、4周龄和7周龄的体重没有显著影响(P＞0.05);SB组血浆中β-羟丁酸(P=0.009)和IGF-1(P=0.010)浓度显著高于Con组，而两组羔羊血浆葡萄糖浓度(P=0.524)没有显著变化;SB灌服显著提高了羔羊瘤胃总挥发性脂肪酸(P=0.020)、乙酸(P=0.048)和丁酸(P=0.002)的浓度以及丁酸比例（P=0.001），显著降低了其它挥发性脂肪酸的比例(P=0.033);SB灌服促进了羔羊瘤胃乳头的生长，具体表现在较高的瘤胃干重(P=0.043)，较大的瘤胃乳头长度(P=0.017)、宽度(P=0.004)和表面积(P=0.002)以及角质层(P=0.017)和总上皮厚度(P=0.048)。相关性分析表明，羔羊瘤胃液中丁酸浓度与瘤胃乳头的长度(P＜0.001;r=0.81)和表面积(P＜0.001;r=0.79)呈显著正相关。结果表明口腔灌服丁酸钠提高了羔羊的生长性能，促进了羔羊的瘤胃发酵和瘤胃乳头的形态发育。 2.口腔灌服丁酸钠对羔羊瘤胃上皮细胞增殖及VFA吸收代谢的影响 试验设计同试验一。在羔羊49日龄最后一次灌服丁酸钠两小时后立即屠宰采样。采集瘤胃上皮组织样品提取RNA检测细胞增殖凋亡及VFA吸收代谢相关基因表达。结果显示:SB灌服显著上调了羔羊瘤胃上皮Cyclin A2(P=0.043)、Cyclin D1(P=0.047)和CDK6(P=0.004)的mRNA表达;SB组瘤胃上皮Caspase-3(P=0.047)和Bax(P=0.020)的mRNA表达显著低于Con组;与Con组相比，SB处理显著上调了羔羊瘤胃上皮IGF-1R(P=0.031)和IGFBP-5(P=0.015)的mRNA表达，下调了IGFBP-3(P=0.023)的mRNA表达。SB灌服显著上调了羔羊瘤胃上皮MCT1(P=0.042),DRA(P=0.019)、HMGCS2(P=0.005)和HMGCL(P=0.015)的mRNA表达，下调了NHE2(P=0.024)mRNA的表达。相关性分析表明:瘤胃液中丁酸浓度与血浆IGF-1浓度(P=0.007;r=0.68)、瘤胃上皮IGF-1(P=0.026;r=0.59)及IGF-1R(P=0.040;r=0.55)的mRNA表达水平呈显著正相关，与瘤胃上皮IGFBP-3(P=0.015;r=-0.63)和Caspase-3(P=0.014;r=-0.64)的mRNA表达水平呈显著负相关;血浆IGF-1浓度和瘤胃上皮Cyclin A2(P=0.036;r=0.56)mRNA表达水平呈显著正相关，与Caspase-3(P=0.041;r=-0.55)mRNA表达水平呈显著负相关。结果表明口腔灌服丁酸钠促进哺乳期羔羊瘤胃乳头的生长与瘤胃上皮细胞增殖的加速和细胞凋亡的抑制相关，并增强了瘤胃上皮VFA吸收和代谢相关基因的表达。丁酸促进羔羊瘤胃上皮生长的作用机制与IGF-1通路密切相关。 3.基于IGF-1信号通路体外研究丁酸钠促进羔羊瘤胃上皮细胞增殖的机理 试验选择体况良好的49日龄羔羊，屠宰后采集瘤胃上皮组织用胰酶消化后获取原代瘤胃上皮细胞。待细胞贴壁后，将细胞分为:对照组(Con，n=4)，2mM丁酸钠处理组(2mM SB，n=4)，4mM丁酸钠处理组(4mM SB，n=4)，8mM丁酸钠处理组(8mM SB，n=4)，丁酸钠+IGF-1R抑制剂组(SB+PPP,n=4)，所有试验重复4次。对照组添加相同体积的DMEM培养基，在细胞处理24h后收集细胞液用于测定IGF-1浓度，收集细胞检测细胞周期以及增殖和凋亡相关基因的表达。结果显示:随着丁酸钠浓度的升高，G0/G1(P＜0.001)和S(P＜0.001)期细胞比例呈二次方变化，8mM和0mM丁酸钠组G0/G1期细胞比例显著高于2mM和4mM丁酸钠组，且8mM丁酸钠组显著高于0mM丁酸钠组，而2mM丁酸钠组显著高于4mM丁酸钠组;4mM丁酸钠组S期细胞比例显著高于0mM、2mM和8mM丁酸钠组，且8mM丁酸钠组显著低于2mM丁酸钠组。随着丁酸钠浓度的升高，G2/M(P=0.007)期细胞比例呈线性降低，8mM丁酸钠组显著降低于0mM、2mM和4mM丁酸钠组。随着丁酸钠浓度的升高，羔羊瘤胃上皮细胞Cyclin A2(P=0.006)和CDK1(P=0.007)的mRNA表达量呈线性降低，8mM丁酸钠组的Cyclin A2表达量显著低于0mM、2mM和4mM丁酸钠组,8mM丁酸钠组的CDK1表达量显著低于0mM和2mM丁酸钠组。随着丁酸钠浓度的升高，羔羊瘤胃上皮细胞Cyclin D1(P＜0.001)、CDK4(P=0.034)和CDK6(P=0.003)的mRNA表达量呈二次方变化，2mM和4mM丁酸钠组的Cyclin D1表达量显著高于0mM和8mM丁酸钠组，且8mM丁酸钠组显著低于0mM丁酸钠组;4mM丁酸钠组的CDK4表达量显著高于0mM、2mM和4mM丁酸钠组;2mM和4mM丁酸钠组的CDK6表达量显著高于8mM丁酸钠组。随着丁酸钠浓度的升高，羔羊瘤胃上皮细胞Caspase-3(P=0.039)和Bax(P=0.008)的mRNA表达量呈线性升高，8mM丁酸钠组显著高于0mM、2mM和4mM丁酸钠组。SB+PPP组在添加SB前1h添加2.5μM的IGF-1R抑制剂(PPP)抑制IGF-1信号通路，在添加SB24h后收集细胞用于增殖和凋亡相关基因表达的分析，收集细胞培养液进行IGF-1浓度的测定。结果显示:添加4mM SB24h后，SB+PPP组的IGF-1浓度(P=0.014)和IGF-1R(P=0.028)mRNA表达量显著低于4mM SB组;此外,Con组和SB+PPP组的瘤胃上皮细胞Cyclin D1(P=0.042)和CDK4(P=0.028)mRNA表达显著低于4mM SB组。以上结果暗示，添加4mMSB可以显著促进羔羊瘤胃上皮细胞增殖，并且主要是通过IGF-1信号通路来发挥作用。
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