摘要
丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins是分布最为广泛，数量最大的一类抑制剂超家族，主要通过调控蛋白酶的活性，在昆虫对病原菌的免疫应答过程中扮演着重要的角色。早有研究表明serpins家族在体液免疫中起主要作用。东亚飞蝗是世界性重要害虫之一，对农业及畜牧业造成严重的危害。实验室前期研究发现金龟子绿僵菌对东亚飞蝗有较好的控制作用，但对东亚飞蝗的免疫机制较少研究。本文为了研究丝氨酸蛋白酶抑制剂在东亚飞蝗抵抗绿僵菌的免疫机制，本文克隆并获得Serpin1蛋白，分别通过饲喂蛋白和RNAi的方法检测了绿僵菌处理后东亚飞蝗的死亡率及体内部分保护酶、解毒酶及水解酶的活性，并测定了脂肪体内免疫相关基因的表达性状，为进一步揭示东亚飞蝗的免疫机制奠定了基础。结果如下: 1.通过qRT-PCR检测了serpin1基因在绿僵菌侵染东亚飞蝗时的表达量升高，表明serpin1参与东亚飞蝗的免疫;serpin1在东亚飞蝗的各个龄期和各个组织中均有表达，且在三龄和表皮中表达量最高。通过克隆和原核表达获得Serpin1蛋白，对serpin1基因序列分析发现:serpin1基因序列为1228bp，开放阅读框为1040bp，共编码346个氨基酸，其蛋白分子量为35.6kDa。 2.通过平板培养及酶活实验验证Serpin1蛋白对绿僵菌体内酶系及蛋白酶的抑制功能。结果表明不同浓度的Serpin1蛋白均不能抑制绿僵菌的生长，但可显著抑制绿僵菌胞外蛋白酶的活性。且不同含量的Serpin1蛋白均可显著抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性，10μg的Serpin1蛋白的抑制效果最高。 3.通过Serpin1蛋白及绿僵菌混合处理东亚飞蝗，验证绿僵菌杀虫效果，并通过酶标法验证不同处理组间保护酶(SOD、POD)、解毒酶(GSTs、MFO)、水解酶(ESTs、AChE)以及PO的活性，qRT-PCR验证Toll通路相关基因(toll、myd88、tube、sp(a)tzle、persephone、defensin)和黑化反应相关基因(PPAE、PPO)的表达机制研究。结果表明将Serpin1与绿僵菌混合后处理东亚飞蝗，显著降低绿僵菌对蝗虫的杀虫效果;Serpin1蛋白与绿僵菌共同处理东亚飞蝗，显著提高了东亚飞蝗体内的保护酶、解毒酶、水解酶以及PO的活性，并可显著提高东亚飞蝗体内Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达。 4.通过干扰虫体的serpin1后，再次施用绿僵菌，并通过酶标法验证不同处理组间保护酶、解毒酶、水解酶以及PO的活性，qRT-PCR验证Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达机制研究。研究表明干扰serpin1，可增加东亚飞蝗的死亡率;致使东亚飞蝗体内的检测7种酶的活性紊乱，并降低东亚飞蝗体内Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达。即serpin1能够增强东亚飞蝗的酶学免疫，提高免疫相关基因的表达。
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