摘要
大豆(Glycine max (L.)Merr.)是世界上重要的粮食和油料作物之一，由古四倍体进化的二倍体植物，基因组较大，且高度重复。已对一些品种和资源进行全基因组测序，并获得序列信息，为大豆基因功能的研究奠定了基础。但由于大豆稳定遗传转化困难，效率低，且受品种差异的影响，导致大豆基因功能的研究进展缓慢。CRIPSR/Cas9基因组编辑技术因经济高效，操作简便，被广泛应用于各类生物的研究中，特别是作物性状改良、基因功能研究及育种等方面。目前CRISPR/Cas9已成功诱导大豆靶标基因发生突变，但由于转化中嵌合体的存在，导致利用组成型启动子诱导的突变不能稳定遗传给后代.本论文围绕特异的大豆CRISPR/Cas9基因组编辑新体系的构建，编辑效率及多靶标位点同时编辑等核心问题及关键技术展开研究，主要工作及结果如下: 1.构建不同的用于大豆转基因发根的CRISPR/Cas9体系，成功诱导大豆内源基因单靶标位点和双靶标位点的突变，其中2X35Sp驱动的CRISPR/Cas9基因组编辑系统可高效诱导双靶标位点的突变，且突变效率与guideRNA的活性相关; 2.基于组成型表达的CRISPR/Cas9成功编辑大豆转基因发根内源基因的基础上，设计并构建了一套简单方便的多靶标位点编辑的CRISPR/Cas9系统，可视化GFP标签及植物除草剂Bar标签共同用于筛选转基因阳性植株或非转基因的突变体;用于同时靶向编辑大豆发根或转基因植株中2或4或6个靶标位点; 3.针对特异性表达的CRISPR/Cas9体系，四个不同的卵细胞启动子(两个源自拟南芥:AtP5p、AtEC1.2e1.1p;两个来自大豆:GmEC1.1p、GmEC1.2p)用于在卵细胞及胚胎早期发育阶段表达Cas9，并利用农杆菌介导大豆的稳定转化。其中AtEC1.2e1.1p∶Cas9成功诱导T1代GmAGO7a发生可遗传突变，编辑效率为26.8％;在T2代转基因植株中检测到靶标位点GmAGO7a和GmAGO7b都发生编辑，说明AtEC1.2e1.1p∶Cas9在T2代卵细胞及胚胎发育早期继续诱导靶标位点发生编辑。GmAGO7b的突变效率很低，同转基因发根中结果一致，表明利用发根体系检测guideRNA的活性是保证高效率突变的行之有效的方法。 4.利用拟南芥辅助研究四个不同卵细胞特异表达CRISPR/Cas9系统的编辑效率。结果显示，T1代，AtEC1.2e1.1p∶Cas9诱导AtRPS4发生双等位基因突变，且突变可遗传;T2代，AtP5p、AtEC1.2e1.1p及GmEC1.1p都介导AtRPS4位点编辑的效率为8.3％到42.9％，但仅AtEC1.2e1.1p∶Cas9的AtRPS4B位点成功编辑，GmEC1.2p并未检测到靶标位点发生编辑;通过植物自身的遗传分离，在T3代获得了非转基因的单靶位点纯合突变体和双靶位点纯合突变体，再次证明靶标位点的编辑效率与guideRNA的活性密切相关;表型鉴定也显示基于Ws背景的突变体是有效的。 综合以上结果，说明特异性表达的CRISPR基因编辑平台，可以在不发生体细胞突变的情况下产生可遗传的大豆和拟南芥突变体，为更有效地研究大豆和拟南芥基因的功能提供了一定的技术支撑。
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