摘要
背景： 中药复方具有组方复杂(君、臣、佐、使)和作用规律多样(相须、相使、相恶)的特点，疗效确切且无严重副作用，体现了中药的治疗优势。但是怎样阐释中药配伍的科学内涵，用科学界的通用语言表征清楚中药配伍的合理性，却是一个重大的挑战。药对，是中医理论指导下固定的两味或三味药物组合。相比于大复方，药对药味简化，易于阐明药效物质与作用机制。药对本身即为小复方，可反映复方配伍的特殊规律与内在联系，因此常作为中药复方配伍规律研究的对象。柴胡-白芍系多个疏肝解郁名方逍遥散、柴胡疏肝散、四逆散等的基础药物。柴胡辛散，疏肝解郁；白芍酸收，养血柔肝，二者散收相合，构成调畅情志复方的核心药对。现代药理研究表明，该药对抗抑郁作用确切。然而，柴胡-白芍药对配伍是否具有增效抗抑郁作用？其增效抗抑郁作用的协同机制是什么？柴胡-白芍药对抗抑郁成分有哪些？其关键成分配伍是否具有协同抗抑郁作用？其协同抗抑郁作用机制又是什么？这些问题尚不清楚。 目的： (1)明确柴胡-白芍药对是否具有配伍增效抗抑郁作用；系统阐明柴胡-白芍药对配伍增效抗抑郁作用的协同机制。 (2)筛选柴胡-白芍药对关键抗抑郁成分，明确该药对关键成分配伍是否具有协同抗抑郁作用；系统阐明该药对关键成分配伍协同抗抑郁机制。 方法： (1)采用网络药理学方法，预测柴胡-白芍药对抗抑郁成分、抗抑郁靶点、抗抑郁通路。构建成分-靶点-通路网络，揭示柴胡、白芍共同调节的靶点和通路，以及独立调节的靶点和通路。从网络药理学角度，阐明柴胡-白芍药对配伍抗抑郁作用的协同机制。另外，通过成分贡献指数分析，筛选柴胡-白芍药对关键抗抑郁成分。 (2)采用慢性不可预知应激抑郁大鼠模型，以大鼠体重和行为学(糖水偏好、旷场穿越格数、强迫游泳不动时间)为指标，评价并比较柴胡、白芍与柴胡-白芍药对分别在低、高同等给药剂量下对大鼠抑郁症状的改善作用，明确柴胡-白芍药对配伍增效抗抑郁作用。以血浆、外周血单个核细胞(PBMCs)、海马为样本，采用LC-MS代谢组学分析技术，发现柴胡、白芍及柴胡-白芍药对调节的差异代谢物和代谢通路；揭示柴胡、白芍所共同调节的差异代谢物和代谢通路，以及独立调节的差异代谢物和代谢通路，从代谢组学角度阐明柴胡-白芍药对配伍增效抗抑郁作用的协同机制。通过关联分析网络药理学和代谢组学结果，并结合代谢通路所含差异代谢物数量，筛选主要代谢通路。采用蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附技术对主要代谢通路及其相关信号通路进行验证，明确柴胡-白芍药对发挥配伍增效抗抑郁作用的关键协同机制。 (3)采用皮质酮损伤PC12细胞模型，以细胞存活率为指标，对网络药理学所预测柴胡-白芍抗抑郁成分进行抗抑郁活性筛选，结合网络药理学结果，筛选柴胡-白芍药对关键抗抑郁成分。采用Chou-Talalay,Loewe和HAS三种协同作用评价数学模型，明确关键成分配伍的协同抗抑郁作用。以PC12细胞为样本，采用LC-MS代谢组学分析技术，发现单用成分及配伍成分调节的差异代谢物和代谢通路；揭示两成分所共同调节的差异代谢物和代谢通路，以及独立调节的差异代谢物和代谢通路，从代谢组学角度阐明成分配伍协同抗抑郁作用机制。通过关联分析网络药理学和代谢组学结果，并结合代谢通路所含差异代谢物数量，筛选主要代谢通路。采用蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附技术对主要代谢通路及其相关信号通路进行验证，明确成分配伍发挥协同抗抑郁作用的关键协同机制。 结果： (1)网络药理学预测结果显示：柴胡抗抑郁成分有19种，调节抑郁靶点179个、通路20条；白芍抗抑郁成分有11种，调节抑郁靶点155个、通路20条。成分-靶点-通路网络拓扑分析结果显示：柴胡和白芍共同调节靶点135个、通路17条；柴胡独立调节靶点44个、通路3条；白芍独立调节靶点20个、通路3条，体现了柴胡-白芍药对配伍多成分-多靶点-多通路抗抑郁作用的协同机制特点。另外，成分贡献指数筛选结果显示：柴胡关键抗抑郁成分3种(柴胡皂苷A、槲皮素、异鼠李素)、白芍关键抗抑郁成分2种(芍药苷、芍药内酯苷)。 (2)抑郁大鼠模型抗抑郁作用评价结果显示：在低、高同等给药剂量下7.5g/kg、15g/kg柴胡-白芍药对均具有配伍增效抗抑郁作用。代谢组学结果显示：血浆中，柴胡调节差异代谢物10个、代谢通路4条，白芍调节差异代谢物9个、代谢通路4条，配伍后调节差异代谢物14个、代谢通路5条；PBMCs中，柴胡调节差异代谢物8个、代谢通路条6，白芍调节差异代谢物9个、代谢通路5条，配伍后调节差异代谢物11个、代谢通路8条；海马中，柴胡调节差异代谢物12个、代谢通路6条，白芍调节差异代谢物10个、代谢通路9条，配伍后调节差异代谢物16个、代谢通路11条。在三个样本中，药对配伍后调节差异代谢物及代谢通路数量均多于单用药。主要代谢通路筛选结果显示：调节花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢为柴胡-白芍药对配伍增效抗抑郁作用的主要协同机制。实验验证结果显示：调节花生四烯酸代谢、嘌呤代代谢、MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路是柴胡-白芍药对发挥增效抗抑郁作用的关键协同机制。 (3)细胞模型抗抑郁作用评价结果显示：柴胡皂苷A、芍药内酯苷分别为柴胡、白芍关键抗抑郁活性成分。协同作用评价结果显示：2.5μmol/L柴胡皂苷A、25μmol/L芍药内酯苷配伍具有最佳协同抗抑郁作用；1.25-2.5μmol/L柴胡皂苷A、12.5-25μmol/L芍药内酯苷配伍是具有协同抗抑郁作用的剂量范围。代谢组学结果显示：柴胡皂苷A调节差异代谢物12个、代谢通路3条，芍药内酯苷调节差异代谢物10个、代谢通路5条，配伍后调节差异代谢物个16、代谢通路7条。成分配伍后调节差异代谢物及代谢通路数量均多于单用药。主要代谢通路筛选结果显示：调节色氨酸代谢、嘌呤代谢、TCA循环、谷氨酸代谢为柴胡皂苷A-芍药内酯苷成分配伍协同抗抑郁作用的主要协同机制；实验验证结果显示：调节色氨酸代谢、TCA循环、嘌呤代谢、谷氨酸代谢、MAPK/NF-κB/NLRP3号通路是柴胡皂苷A-芍药内酯苷成分配伍发挥协同抗抑郁作用的关键协同机制。 结论： (1)柴胡-白芍药对及其关键抗抑郁成分柴胡皂苷A-芍药内酯苷确有配伍增效抗抑郁作用。 (2)柴胡-白芍药对及其关键抗抑郁成分柴胡皂苷A-芍药内酯苷配伍具有多成分-多靶点-多通路配伍增效抗抑郁作用的协同机制，其关键协同机制为调节色氨酸代谢、TCA循环、谷氨酸代谢、嘌呤代谢、MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路。
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