摘要
三乙酸内酯作为一种小分子聚酮平台化合物，应用广泛。以乙酸为原料的化学合成法及植物提取法存在环境污染严重、石油资源依赖性强、生产周期长等诸多问题。以可再生生物质为原料，通过构建微生物细胞工厂生产三乙酸内酯成为解决上述问题的新方法。解脂耶氏酵母胞内具有高通量的聚酮前体乙酰辅酶A代谢流，是工业化生产三乙酸内酯的优势底盘。木质纤维素来源的葡萄糖与木糖可作为微生物合成三乙酸内酯的廉价原料，但木糖的低效转化是目前尚待解决的关键问题。因此，本课题通过构建并优化木糖代谢途径，结合碳流及能量流调控，实现木糖向三乙酸内酯的高效转化，具体研究内容包括: (1)以解脂耶氏酵母为出发菌，通过表达2-吡喃酮合成酶，成功构建了三乙酸内酯合成途径，以葡萄糖为原料，TAL产量达到0.72g/L。在此基础上，分别过表达内源及树干毕赤酵母来源的木糖代谢途径，提高了工程菌对木糖的利用效率，TAL产量可分别达到1.27g/L、1.60g/L。 (2)2-吡喃酮合成酶的活性依赖于辅因子NADPH，本研究比较了解脂耶氏酵母工程菌利用葡萄糖及木糖合成三乙酸内酯过程中胞内NADPH含量，表明代谢木糖时胞内总还原力高于葡萄糖。进一步，分别过表达了mae、mndh1、mndh2、idp2、zwf1、gnd1、gnd2等7种NADPH循环系统的关键基因，但TAL的产量提升不明显，表明木糖代谢产生的还原力可以满足TAL的合成。 (3)为提高工程菌转化木糖的效率，课题进一步探究了碳氮比、pH及副产物等因素对三乙酸内酯合成的影响，确定了最优碳氮比为80∶1，以0.2MPBS缓冲液调控pH，添加1.5mg/L浅蓝菌素抑制副产物脂肪酸合成，TAL产量提高至4.99g/L，较未优化时提高了2.1倍。达到了目前报道摇瓶中的最高水平。 本研究通过优化并调控木糖转化合成三乙酸内酯的代谢途径，成功构建了可高效利用木糖合成三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌，为实现木质纤维素原料转化合成聚酮化合物的研究奠定了基础。
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