摘要
三系杂交稻是水稻杂种利用的主要形式。在生产上，三系杂交籼稻主要利用野败(WA)型不育胞质，育种材料中微效恢复基因的存在造成保持系选育盲目性大、选育效率低，同时也会导致不育系不育性不稳定，这一定程度上制约了三系杂交籼稻的发展。然而，当前对WA型恢复基因的研究主要集中于对恢复系中主效基因的研究，对微效恢复基因，尤其是不育系/保持系中恢复基因的研究较少，尚未见微效恢复基因被准确定位的报道。 本课题组前期的研究中，利用以日本晴为供体、籼稻品种9311为背景构建的染色体片段代换系(命名为C1-C128)为材料，鉴定了一个来源于日本晴中的WA型微效恢复基因Rf21(t)，并发现其与9311中携带的WA型恢复基因存在互作。本研究中，通过构建染色体单片段叠代系对Rf21(t)基因进行精细定位与克隆，并采用构建同质恢材料及图位克隆的方法对9311中的WA型恢复基因进行鉴定与定位。具体研究结果如下: 1.根据代换系重测序结果发现，代换系群体中f6位点所在染色体区段尚未被有导入片段覆盖，C31、C34、C47、C115、C116及C119等6个系中Rf5位点所在染色体区段被日本晴片段替换。利用WA型不育系五丰A、天丰A与C31等6个代换系及9311分别测交，对测交F1植株的育性鉴定结果表明，植株均以黑染花粉为主，9311、C31、C34、C47、C115及C116等系的测交后代小穗育性几乎为0，C119测交后代小穗育性显著提高。该结果表明9311中确带有WA型恢复基因，其对WA型籼稻不育系的恢复力与Rf5无关。 2.本实验室前期研究中，利用9311/C119F2-3群体将Rf21(t)定位于第1号染色上标记RM5310和RM12182之间约为187kb物理区间内，并获得18个重组个体。本研究中，利用分子标记辅助选择技术，构建了33个覆盖目标区段的染色体片段叠代系(9311/C119F4-7株系);在目标区段内开发了18对多态标记对叠代系进行检测，将叠代系分为22类。根据叠代系测交后代的小穗育性及基因型，我们发现Rf21(t)位点上存在两个相关的基因，分别命名为Rf21a(t)与Rf21b(t)，其中Rf21a(t)位于标记RM8235与标记RM3602两个标记之间约570kb的物理距离内，Rf21b(t)位于标记ID01M28826位与标记ID01M28865间约为50kb的物理距离内。 3.在恢复基因Rf21b(t)定位区间内，包含2个具有明确注释的基因LOC_0s01g71310和LOC_Os01g71320。LOC_Os01g71320编码己糖激酶，通过测序及表达分析，确定LOC_Os01g71320为Rf21b(t)的候选基因。 4.对可育测交系与部分不育测交系中WA352表达量进行检测，结果表明，可育测交系植株中WA352表达量较部分不育测交系显著降低，表明Rf21(t)通过促进含WA352的转录本的降解来恢复WA型不育系的育性。 5.利用分子标记辅助选择技术，以天丰B为供体，获得9311背景的近等基因系NILrf6及多基因聚合系PPLrf5+rf6;利用WA型不育系与NILrf6、PPLrf5+rf6进行测交，测交后代均表现为黑染花粉，小穗育性与对照无明显差异，表明9311对WA型不育系的恢复力非由f6所致。 6.本研究中构建了以C31为供体，天丰A为背景的高代回交株系T8621(BC8F2);遗传分析表明，T8621衍生群体中植株育性分离受单基因控制，将该基因暂定名Rf24(t);利用基因芯片检测技术鉴定到T8621中3个导入片段，分别位于第1、3、9号染色体上，基因定位结果表明，Rf24(t)位于第1号染色体上ID01M4539与RM243间。
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