摘要
背景和目的 肾脏缺血再灌注损伤是急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的主要病因，是肾功能在短期内急性减退为特征的疾病，虽然损伤是可逆的，但是这种疾病伴随着很高的死亡率和转变成慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease，CKD)的风险。目前肾脏缺血再灌注损伤的发病机制尚不清楚。前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸的代谢产物，主要通过作用4个受体亚型—EP1，EP2，EP3和EP4参与肾脏生理和病理生理过程。其中，EP4在肾脏和血管中广泛的表达，并且参与肾脏水盐代谢和血压的调节，前期有研究发现EP4激动剂可以减轻毒性物质引起的急性肾损伤，但血管内皮细胞EP4在肾脏缺血再灌注损伤中的作用目前还未有报道。本课题将在组织特异的转基因模式动物上，阐明血管内皮细胞EP4在肾脏缺血再灌注损伤中的作用和机制，为该疾病的临床防治提供新的理论基础。 方法 1.探索血管内皮细胞EP4缺陷对肾脏缺血再灌注损伤肾功能的影响。 首先，采用Cre-loxp技术构建内皮细胞特异的EP4缺陷小鼠(EP4△EC)，同笼的EP4flox/flox小鼠作为对照。通过基因鉴定和分离血管内皮细胞证实所获得小鼠确为内皮细胞特异的EP4缺陷小鼠。在以上小鼠通过双肾动脉夹闭制备肾脏缺血动物模型，使用生化手段检测血流再通24小时和14天后小鼠血肌酐、尿素氮及尿蛋白的变化，验证血管内皮细胞EP4缺陷小鼠肾脏缺血再灌注后肾代谢功能的变化。肾脏组织样本PAS染色判断肾脏损伤程度和部位。 2.探讨血管内皮细胞EP4参与肾脏缺血再灌注损伤时细胞死亡的分子机制。 EP4△EC和EP4flox/flox小鼠肾脏缺血再灌注后24小时和14天的肾脏样本，使用TUNEL染色和westernblot检测bax和caspase3的剪切体(Cleaved-caspase3)表达评估肾脏细胞凋亡情况。WesternBlot检测肾脏组织中GSDMD的表达评估肾脏细胞焦亡程度。WesternBlot检测肾脏组织MAPKs主要成员JNK，p38和ERK1/2的磷酸化水平，在整体水平探讨EP4影响肾脏凋亡和焦亡的分子机制。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，氯化钴处理模拟在体低氧环境，通过使用EP4及其经典下游PKA和Epac1的活性药物处理后，WesternBlot检测细胞Cleaved-caspase3，caspase1，GSDMD以及p-JNK的表达验证内皮细胞EP4是否通过JNK调控细胞凋亡和焦亡过程。 3.探讨血管内皮细胞EP4在肾脏缺血再灌注后转归过程中作用和分子机制。 EP4△EC和EP4flox/flox小鼠肾脏缺血再灌注后14天的肾脏样本，免疫荧光检测CD31阳性细胞判断肾间质毛细血管结构和数量。免疫组化检测PCNA检测肾脏的细胞再生状况。天狼猩红染色和westernblot检测α-SMA表达评估肾脏纤维化程度。WesternBlot检测肾脏组织smad3的磷酸化水平在整体水平探讨EP4调节血管新生和组织纤维化分子机制。在HUVECs应用EP4及其经典下游PKA和Epac1的活性药物处理后，WesternBlot检测细胞α-SMA和p-smad3的表达验证内皮细胞EP4是否调控血管新生和内皮细胞向成纤维细胞转化(Endothelial to mesenchymal transition，EndoMT)进程并阐明其作用机制。 结果 1.血管内皮细胞EP4缺陷加重肾脏缺血再灌注后肾脏滤过功能的损伤，以及肾脏实质细胞的损伤和坏死。 肾脏缺血再灌注24小时后，小鼠血肌酐和尿素氮、尿中尿蛋白含量均较假手术组升高，且缺陷小鼠升高的更为显著;而在再灌注14天，对照组小鼠血肌酐和尿素氮及尿蛋白明显降低，但缺陷小鼠这种改善并不显著。与之相对应的，病理学结果发现肾脏缺血再灌注24小时肾脏组织出现大量的蛋白管型和小管坏死的表型，在缺血再灌注14天时对照组小鼠病理学变化基本恢复，而缺陷小鼠肾脏组织中仍然存在蛋白管型和小管坏死的表现。 2.血管内皮细胞EP4在肾脏缺血再灌注损伤急性期和慢性期，分别通过抑制低氧诱导的内皮细胞p-JNK表达进而抑制凋亡和焦亡发挥保护作用。 在肾脏缺血再灌注24小时以及14天均存在TUNEL阳性细胞数量增加的现象，在缺血再灌注24小时，肾脏组织凋亡相关指标bax和caspase3的剪切体表达上调，在14天无显著差异;但在再灌注14天时，EP4△EC小鼠出现焦亡相关蛋白N-GSDMD表达上调的趋势。 体外细胞实验发现，EP4的激动剂可以显著改善低氧状态下细胞的凋亡和焦亡相关蛋白的表达，并且抑制JNK磷酸化的激活;与之相对应的EP4的拮抗剂可以增加JNK的激活，表明了EP4通过p-JNK来抑制凋亡和焦亡发挥保护作用。 3.血管内皮细胞EP4通过促进血管新生和抑制smad3拮抗EndoMT参与肾脏缺血再灌注损伤后的肾脏修复过程。 在缺血再灌注14天时，EP4△EC肾间质毛细血管减少。同时，EP4激动剂可以促进体外内皮细胞成管，而EP4拮抗剂可以抑制这一现象。并且缺血再灌注14天后，EP4△EC肾脏纤维化病理表现和纤维化相关蛋白α-SMA以及smad3均显著高于对照小鼠。同样的EP4的激动剂可以抑制smad3磷酸化和纤维化蛋白的增加，拮抗剂促进smad3磷酸化和纤维化蛋白的增加。 结论 血管内皮细胞中EP4通过调控JNK的活化来减少细胞凋亡和焦亡以及抑制血管新生和EndoMT，共同作用参与肾脏缺血再灌注损伤及损伤后修复过程。这些发现有助于我们更好的理解在肾脏缺血再灌注损伤中内皮细胞EP4的功能和重要性，为防治急性肾损伤提供了新思路和新靶点。
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