摘要
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种具有抗氧化和解毒重金属功能的硫醇小分子三肽，广泛存在于各种生物体中。GSH在生物体内的含量远高于金属硫蛋白、植物螯合肽等解毒重金属多肽，其通过巯基螯合金属离子，并与GPX酶共同作用来保护生物体。通过对其调控基因的改造实现生物体对有害金属耐受性的增强和谷胱甘肽生产能力的提高，具有重要的理论意义和应用价值。 嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种自由生单细胞纤毛类原生动物，无细胞壁，对环境污染物敏感，具有环境相适应的重要功能基因家族，是经典的探究细胞对环境污染物的降解和解毒、高效抗氧化效应的模式生物。本研究以嗜热四膜虫为研究对象，鉴定了GSH合成途径的谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和谷胱甘肽合成酶基因,对基因的功能进行了分析，获得的结果如下： 1.嗜热四膜虫谷胱甘肽合成基因GSH1和GSH2的生物信息学分析 基于嗜热四膜虫基因组数据库和功能基因组数据库，通过生物信息学分析，鉴定出嗜热四膜虫谷胱甘肽合成途径的关键酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1(TTHERM_00250970)和谷胱甘肽合成酶基因GSH2(TTHERM_01049360)。GSH1开放阅读框1881bp，编码626个氨基酸；GSH2开放阅读框1938bp，编码645个氨基酸。GSH1和GSH2在营养生长期、饥饿期、有性生殖期表达，接合配对诱导表达水平的显著上调。在金属离子Cd2+和Pb2+的胁迫下，野生型嗜热四膜虫的GSH1和GSH2表达水平显著上调。GSH1和GSH2分别进行系统发育分析，发现两个基因，具有相似的进化分支，存在协同进化模式。蛋白质相互作用分析发现二者均与合成谷胱甘肽的前体物质半胱氨酸合成相关的蛋白存在相互作用。 2.GSH1敲除突变体细胞对Cd2+和Pb2+的敏感性增强 构建GSH1基因敲除载体pNeo4-GSH1，基因枪转化嗜热四膜虫，通过同源重组和抗性筛选，获得GSH1基因敲除突变体细胞株KO-GSH1。在Cd2+和Pb2+的胁迫下，野生型细胞的IC50值分别为30.77μM、15.35μM，而KO-GSH1细胞的IC50值分别为26.46μM、13.39μM，GSH1的敲除导致细胞对重金属离子胁迫的敏感性增强。进一步分析发现，KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量下降了85%；在Cd2+和Pb2+的胁迫下，KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量分别下降了95%和94%，野生型细胞株谷胱甘肽的含量下分别下降了55%和53%。然而，在Cd2+和Pb2+胁迫下，KO-GSH1 细胞的MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT基因表达水平均显著上调，结果表明KO-GSH1突变体通过上调金属硫蛋白基因和抗氧化酶基因的表达水平来抵抗Cd2+和Pb2+的胁迫。 3.GSH1和GSH2基因过表达细胞对Cd2+和Pb2+的耐受性增强 构建MTT1启动子调控下的过表达载体pXS75-GSH1和pXS75-GSH2，基因枪转化嗜热四膜虫，筛选获得过表达细胞株OE-GSH1和OE-GSH2。免疫荧光定位分析表明，HA-Gsh1和HA-Gsh2均定位在细胞质中。在Cd2+和Pb2+胁迫下OE-GSH1的IC50分别为35.15μM、18.13μM，OE-GSH2的IC50分别为33.98μM、17.58μM均高于野生型，表明OE-GSH1和OE-GSH2均对Cd2+和Pb2+的耐受性增强。在Cd2+和Pb2+胁迫下，OE-GSH1和OE-GSH2突变体中的GSH1和GSH2的表达水平均显著上调，谷胱甘肽的含量均显著上升。然而金属硫蛋白基因MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT的表达水平显著下降。结果表明，OE-GSH1和OE-GSH2细胞通过上调GSH1和GSH2的表达水平增加谷胱甘肽的含量以此来增加对Cd2+和Pb2+的耐受性，谷胱甘肽、金属硫蛋白和抗氧化酶系统协同参与了四膜虫对Cd2+和Pb2+的解毒功能。 综上所述，本研究首次鉴定了四膜虫GSH合成基因，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1和谷胱甘肽合成酶基因GSH2，嗜热四膜虫GSH1敲除突变体中谷胱甘肽合成下降。在重金属离子胁迫下，敲除突变体细胞中的金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达上调。相反，GSH1和GSH2的上调表达，导致金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达下调。在环境重金属胁迫下，GSH合成途径和金属硫蛋白及抗氧化酶系统存在相互功能补偿，在四膜虫重金属离子解毒过程中发挥重要的调节作用。
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