摘要
背景 急性髓系白血病(AML)是一组以未分化髓系前体细胞克隆性扩增，导致正常造血功能受损和造血衰竭为特征的临床异质性疾病。尽管70-80％病人对诱导化疗有效，但是难治/复发AML仍然常见，是AML治疗过程中的一大挑战。精细的风险分层有助于帮助我们区分出可能复发的AML患者，但也会存在危险分层为低危的患者出现高危表现(如复发)这一矛盾现象，提示现有的风险分层体系仍有待改善。体细胞突变是AML发生发展的主要原因，成千上万种突变造成了AML的生物学异质性和临床复杂性。每位AML患者所存在的突变种类、比例、伴随的共突变均不相同。近年来随着检测技术的进步，如二代测序技术、单细胞测序技术、全转录组测序技术等等，促使我们进一步探索基因改变在AML发生发展中的重要作用。 半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(CSRP2，cysteine and glycine-rich protein 2)参与调节器官生长和细胞分化进程。相较于分化良好(WD)的肝细胞肝癌(HCC)，CSRP2在中等分化(MD)HCC中高表达，被认为与肝细胞肝癌的去分化有关。在许多癌症中存在异常的CSRP2表达，但是CSRP2的功能仍未完全阐明。Hoffmann等人研究发现，CSRP2作为伪足肌动蛋白束的重要组分，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)可上调其表达水平，有利于乳腺癌细胞的侵袭和转移。此外研究证实，CSRP2作为miR-27a的下游靶标，下调CSRP2表达可促进胃癌癌细胞的增殖和运动。CSRP2在结直肠癌中低表达。CSRP2过表达可抑制结直肠癌侵袭、迁移;其下游机制主要通过激活CSRP2/p130Cas/Racl通路，以及下游Hippo，ERK，PAK通路等。小分子肽W15是从CSRP2分离出的，在人表皮成纤维细胞(HDF)和斑马鱼上均显示出较强的抗氧化活性，而剂量毒性暂未观察到。CSRP2在急性髓系白血病中的表达、临床意义及生物学作用研究仍是空白。 目的 本文通过临床样本探索CSRP2在AML中的表达水平及其表达水平高低与AML患者临床特征和预后的关系。利用慢病毒转染技术在AML细胞系HL-60中敲低CSRP2，并通过体外试验研究CSRP2对AML增殖、周期、凋亡、耐药等生物学功能的影响及其可能机制。 方法 1.通过使用实时定量聚合酶链式反应(real quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技术检测193例新诊断的成人AML患者和44例健康对照的CSRP2的表达水平，按照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)》对AML患者进行细胞遗传学危险分层。 2.统计AML患者临床数据，随访截止至2020.06.01。 完全缓解(CR):骨髓穿刺涂片中原始细胞＜5％，无伴Auer小体的原始细胞和无髓外白血病持续存在，脱离输血，中性粒细胞绝对计数＞1.0×109/L，血小板＞100×109/L; 复发:骨髓中原始细胞≥5％，或外周血中又出现原始细胞，或出现髓外疾病; 总生存(0S):患者初诊到患者死亡或随访截止日; 无复发生存(RFS):仅用于评价达CR患者，自达到CR到患者死亡、复发或随访截止日，以复发为事件; 累计复发率(CIR):仅用于评价达CR患者，自达到CR到患者死亡、复发或随访截止日，以复发为事件，非复发死亡为竞争事件。 使用竞争风险模型计算CIR，使用Kaplan-Meier计算RFS，使用Cox回归模型进行多因素分析。 3.挑选CSRP2相对高表达AML细胞系HL-60，行预实验确定病毒感染复数(MOI)和嘌呤霉素最小致死浓度(LDH)。行慢病毒(空白对照病毒、CSRP2shRNA1/2)转染，成功构建稳转细胞株:CSRP2CTRL(空白对照病毒细胞株)、CSRP2KD1(CSRP2敲除细胞株1)、CSRP2KD2(CSRP2敲除细胞株2);用RT-qPCR和WesternBlot(WB)的方法验证稳转效率。 4.使用CellCountingKit-8(CCK-8)实验检测CSRP2CTRL、CSRP2KD1/2细胞增殖、加入柔红霉素后细胞增殖，WB检测增殖相关蛋白包括MAPK、CREB、AKT、p-SMAD3等。 5.使用流式细胞术实验检测CSRP2CTRL、CSRP2KD1/2细胞各个周期阶段(G1、S、G2/M)比例，WB检测周期相关蛋白包括CyclinD1、CDK4、p27、p21、p53等表达水平。 6.使用流式细胞术实验检测CSRP2CTRL、CSRP2KD1/2细胞凋亡。 结果 1.CSRP2的转录水平在成人AML患者(中位数3.76％，范围(0-280.88％))中显著高于正常对照(中位数0.44％，范围(0-1.78％)，P＜0.0001);CSRP2的转录水平与AML的细胞遗传学危险分层相关:低危的AML患者(中位数20.09％，范围(0.09-280.88％))比高危AML患者(中位数2.15％，范围(0.08-177.86％))的CSRP2转录水平高(P=0.005)。 2.在193例成人AML患者中，39.4％(n=76)患者存在CSRP2高转录。与CSRP2高转录患者相比，CSRP2低转录患者存在较高的白细胞水平、较高的血小板水平、较高的危险分层。基因突变如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA更常见于CSRP2低转录患者;而CEBPA双突变、AML1-ETO融合基因更常见于CSRP2高转录患者。 3.在193例成人AML患者中，149例患者获得CR:包括108例仅接受化疗的患者和49例接受造血干细胞移植的患者。对于149例获得CR的患者中，CSRP2低转录水平的患者(n=90)表现出较低的两年RFS和较高的两年CIR相较于CSRP2高转录水平的患者(n=59)((RFS:45％ (30-60％)vs.75％ (58-92％); CIR:51％(37-65％)vs.22％(7-37％));108位只接受化疗的患者，CSRP2低转录水平的患者表现出较低的两年RFS和较高的两年CIR相较于CSRP2高转录水平的患者(RFS:30％ (12-48％)vs.71％ (47-94％);CIR:65％(47-83％)vs.25％(4-46％))。 4.多因素分析显示:较高水平的CSRP2转录水平、危险分层为低危、异基因HSCT是较好RFS的独立相关因素。 5.CCK-8实验表明KD1和KD2的增殖明显高于CTRL;用含有盐酸柔红霉素的培养基培养CSRP2-CTRL、CSRP2-KD1、CSRP2-KD2，再通过CCK-8实验检测细胞增殖，KD2显示出更高的增殖活性。 6.相较于CSRP2-CTRL细胞，CSRP2-KD1/KD2细胞G2/M期细胞比例升高，而G0/G1期比例下降;敲低CSRP2，降低p21、p27(细胞周期抑制蛋白)的表达水平。 7.在CSRP2-KD细胞中，ERK和P38的磷酸化水平下调;促增殖分子如p-AKT，p-CREB表达水平上调。 8.p-CREB的抑制剂KG-501可显著抑制p-AKT，p-CREB表达水平;抑制p-CREB后CSRP2-KD1/KD2细胞株的增殖活性降低。 结论 1.CSRP2在成人AML患者中高表达 2.CSRP2转录水平与成人AML患者的复发相关 3.敲低CSRP2促进AML细胞增殖和化疗耐药 4.敲低CSRP2促进AML细胞的周期进程 5.敲低CSRP2可能通过p-AKT和p-CREB通路介导AML细胞增殖。
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