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基于单细胞转录组分析揭示食管鳞状细胞癌发展中的细胞状态

秦斌

基于单细胞转录组分析揭示食管鳞状细胞癌发展中的细胞状态

秦斌1
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作者信息

  • 1. 郑州大学
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摘要

背景和目的 食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是指原发于食管黏膜上皮或腺体的恶性肿瘤,临床上以进行性吞咽困难为其最典型的症状,其发病率占全世界恶性肿瘤发病率的第八位,严重威胁到全人类的健康。食管癌按照组织学类型主要可分为食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)两种类型。腺癌是西方国家最常见的一种食管癌类型,占所有新发病例的一半以上。我国是食管癌的高发地区且鳞状细胞癌约占全球食管癌总数的90%,它发病率高,预后差,五年生存率仅为30.3%,是我国恶性肿瘤中常见的死亡原因。在食管癌的发展过程中,肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作用发挥重要的作用,并且影响ESCC的治疗效果。肿瘤细胞的演化种类和免疫细胞的异常尤其重要,其中涉及到包括基质、血管、淋巴管、免疫细胞等因素的相互作用。而这种复杂的免疫微环境的变化对于ESCC的发生、发展及患者生存期和免疫治疗的有效性紧密相关。同时,ESCC细胞含有丰富的肿瘤抗原,包括肿瘤相关抗原和新抗原。因此,探索肿瘤组织内各种细胞的表达谱,鉴定识别各种细胞的生物标记物将不仅有利于ESCC的早期发现,更能够为个体化的免疫治疗提供靶点。而传统的研究手段在免疫微环境的研究中都有其局限性,近几年出现的单细胞转录组测序技术,可对食管癌肿瘤细胞和肿瘤微环境进行深度探索,鉴定肿瘤的不同细胞分群并通过不同亚群的表达图谱,寻找与生存相关的亚群细胞、分子生物标志物等。同时使用此技术,可以通过激活的T细胞的V(D)J测序,筛选出可能用于今后免疫治疗的个体化的TCR(T cell receptor,TCR)序列。本文通过单细胞测序对临床ESCC肿瘤样本进行分析,探索ESCC肿瘤的形成机制,并帮助我们了解其复杂的肿瘤微环境,为发现ESCC预测性生物标志物和为免疫治疗的新型有效策略提供了新的方向。 方法 本研究首先通过胶原酶消化法,建立符合质检标准的ESCC肿瘤组织单细胞获取方法。之后收集2例临床ESCC病人肿瘤组织样本,利用建立的单细胞获取优化方案对患者肿瘤组织进行单细胞制备并进行活性鉴定,以获得质检合格的单细胞。根据本课题的后续分析需要,应用免疫吸附磁珠法将获得的单细胞分选出CD45阳性细胞和CD45阴性细胞,然后通过10×genomics系统捕获单个细胞样本并构建测序文库,进行单细胞转录组测序。通过数据的筛选和标准化,用CellRanger对数据进行处理,通过降维聚类对细胞进行分群,确定肿瘤微环境中的细胞种类,同时分析出各个细胞群的特异性表达基因。在细胞种类确定后,我们又根据两个病人样本分群的特征,进行了上皮细胞的进一步分群分析,具体研究不同病人的肿瘤异质性,分析肿瘤上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的标志物,并结合TCGA数据库中ESCC临床病人数据,分析在不同亚群中的单个基因表达与ESCC病人生存率的关系。后续对肿瘤组织和癌旁组织石蜡切片进行HE染色(苏木精-伊红染色法)以及多色免疫荧光实验,验证单细胞测序发现的肿瘤细胞类型以及肿瘤微环境变化。 结果 (1)使用浓度为0.2mg/mlⅠ型胶原酶和0.2mg/mlⅣ型胶原酶混合消化法,对于重量在1g以内的ESCC组织,室温消化40min,即可获得细胞活率在70%以上的单细胞悬液;并通过对获取的肿瘤组织单细胞悬液进行流式细胞术验证,确定通过CD45磁珠分选技术获取的CD45阳性细胞和CD45阴性细胞数量和活力的有效性; (2)成功绘制ESCC肿瘤微环境细胞图谱,共确定12余种细胞类型,包括免疫细胞9种,分别为T细胞、B细胞、NK细胞以及其亚群细胞;非免疫细胞3种,包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞,并分别计算得出其数量和比例(CD4阳性T淋巴细胞共858个,占总细胞数的1%,CD8阳性T淋巴细胞共1,356个,占总细胞数的2%,等其它细胞); (3)利用CD45阴性细胞群中的上皮细胞再次分群的标记基因,结合TCGA数据库中的ESCC的临床样本数据,发现了一类具有内皮细胞上皮化特征的细胞群(该群细胞差异性表达top基因为PECAM1、RAMP2、FLT1等基因)与ESCC病人的生存显著相关; (4)对CD45阴性细胞中上皮细胞的上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因进行了分析,发现了与ESCC相关的EMT的标记基因,包括上皮细胞标记物的低表达,如钙黏着蛋白1(E-Cadherin/CDH1)和层粘连蛋白(LAMA2);间质细胞标记物的高表达,如波形蛋白(Vimentin/VIM)和纤连蛋白fibronectin/FN1)等; (5)通过对CD45阳性细胞群的分类与其V(D)J测序结果分析,发现了多个具有相同TCR激活的CD8阳性T淋巴细胞。 结论 本研究通过对获取的CD45阳性细胞和CD45阴性细胞进行单细胞转录组测序,明确了ESCC微环境的成分,鉴定了不同细胞群的标记基因,绘制了细胞图谱,研究相关功能基因的表达,并通过对肿瘤微环境中的上皮细胞分析,结合相关生存分析,确定与上皮细胞的恶性进化相关的一组关键过渡标志细胞群。我们推测其是ESCC的进化相关的标记细胞群。通过对肿瘤微环境中的CD45阳性细胞分析,发现多个具有相同TCR序列并激活的CD8阳性T淋巴细胞,我们推测其可能是ESCC特异性抗原相关的TCR。

关键词

食管鳞状细胞癌/单细胞转录组测序/肿瘤微环境/上皮细胞/临床病理

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授予学位

硕士

学科专业

病理学与病理生理学

导师

王志民

学位年度

2021

学位授予单位

郑州大学

语种

中文

中图分类号

R73
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