摘要
背景和目的 旋毛虫病的发生是由于食入含有旋毛虫幼虫囊包的生肉或半生肉引起的一种人兽共患疾病。该病可以引起消化道症状如恶心、呕吐、腹痛、腹泻以及肌痛、全身发热和眼睑水肿，甚至是更严重的脑炎和心肌炎。旋毛虫侵入肠上皮细胞(IECs)并进一步发展是使宿主引起感染的关键。旋毛虫氨基肽酶P(Trichinella spiralis aminopeptidase P，TsAPP; GenBank:EFV57850)是本课题组前期在旋毛虫感染性幼虫(IIL)与IECs体外共培养后产生新蛋白中，通过质谱分析鉴定出来的，故推测该蛋白可能与旋毛虫侵入宿主的IECs有关。本研究中克隆表达了TsAPP基因，获得了重组TsAPP(rTsAPP)。采用RT-PCR和Westernblot分析TsAPP在旋毛虫不同发育阶段的转录和表达，并利用免疫荧光抗体试验(IFA)分析TsAPP在虫体的定位。用特异性底物—L-丙氨酰基-L-脯氨酸(H-Ala-Pro-OH)的水解法测定rTsAPP的酶活性。应用Westernblot、ELISA和IFA检测了rTsAPP与血红蛋白(Hb)的结合。本课题组前期的研究表明，旋毛虫组织蛋白酶X(TsCX，GenBank:XM_003372890.1)重组蛋白可促进旋毛虫幼虫对小鼠IECs的侵入，可能是抗肠道期旋毛虫阶段疫苗的潜在靶分子。将rTsAPP与重组的旋毛虫组织蛋白酶X(rTsCX)分别或混合皮下免疫小鼠，检测免疫小鼠的体液免疫应答以及旋毛虫攻击感染后的免疫保护。 材料与方法 1.旋毛虫虫种、实验动物、菌种 本研究所用为旋毛虫T1种(T.spiralis)，于本实验室KM小鼠保种;实验动物为从河南省实验动物中心购入的BABL/c小鼠;克隆与表达菌为E.coliBL21。 2.TsAPP生物信息学分析 使用BioEdit等软件对TsAPP与其他种旋毛虫氨基肽酶P的序列进行比对，用MEGA7.0的邻接法构建TsAPP的系统发育进化树。在NCBI和SMART等网站对TsAPP的结构域和酶活性位点进行预测。 3.TsAPP的克隆表达及抗原性分析 TsAPP基因连接至pMD19-T经双酶切将TsAPP基因连接到pQE-80L表达载体上，构建重组质粒pQE-80L/TsAPP。将纯化的rTsAPP免疫小鼠制备抗rTsAPP免疫血清。应用Westernblot对TsAPP的抗原性进行分析。 4.TsAPP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位 制备不同虫期粗抗原，经Westernblot分析TsAPP在各个虫期的表达情况。用Trizol提取旋毛虫各个不同虫期的RNA并反转录为cDNA，包括[肌幼虫(ML)、肠道感染性幼虫(ILL)、成虫(AW)、新生幼虫(NBL)]。通过RT-PCR分析TsAPP基因在不同虫期的转录水平。将旋毛虫不同虫期的虫体制成的蜡片应用IFA技术观察TsAPP在旋毛虫不同虫期的表达及定位。 5.rTsAPP酶活性测定 氨基肽酶P具有催化特异性底物H-Ala-Pro-OH(L-丙氨酰基-L-脯氨酸)水解产生Pro的能力，脯氨酸与茚三酮在酸性条件下生成的直接产物是红色的，特征吸收峰为520nm，通过测定520nm处吸光值的变化，可计算出氨基肽酶P的酶活力。本文观察了重组旋毛虫氨基肽酶P在不同反应温度、pH值及金属离子和抑制剂下其酶活性的变化。 6.rTsAPP与血红蛋白的结合 应用Westernblot、ELISA法和IFA检测了rTsAPP与鼠和猪血红蛋白(Hb)的特异性结合，以抗重组的旋毛虫氨基肽酶(rTsAP)为对照。 7.抗rTsAPP及rTsCX抗体介导的细胞毒试验(ADCC) 将旋毛虫新生幼虫与小鼠的腹腔渗出细胞混合后加入孔中，加入不同稀释度的血清(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)，每个组别设置3个复孔。培养至72h，每24h记录每孔新生幼虫存活情况。存活的新生蚴具有可移动性，而死的新生蚴僵直无活动性。以每次试验中观察到的死亡幼虫占总幼虫的百分比来确定各个不同组血清的细胞毒性。 8.rTsAPP与rTsCX联合免疫小鼠所诱导的体液免疫应答 将250只BALB/c小鼠分为5组(每组50只)，分别用rTsAPP、rTsCX、rTsAPP+rTsCX、ISA201佐剂和PBS进行皮下免疫3次，免疫间隔为2周，将收集的不同组血清，应用肌幼虫粗抗原ELISA法检测每组小鼠血清中的特异性IgG、IgG2a、IgG1及IgA水平。在免疫前、末次免疫后2周以及攻击感染后2周，应用ELISA检测了肠液中的总sIgA及特异性sIgA;收集小鼠脾脏、肠系膜淋巴结以及PP结，检测Th1型(IFN-γ)与Th2型(IL-4)细胞因子的水平。 9.rTsAPP与rTsCX联合免疫小鼠产生的免疫保护效果 末次免疫后2周，应用300条旋毛虫肌幼虫对所有免疫小鼠进行经口攻击感染。感染后7d与46d每组剖杀10只，观察肠道旋毛虫成虫荷以及肌幼虫荷，计算rTsAPP、rTsCX、rTsAPP+rTsCX免疫小鼠的减虫率，评价rTsAPP、rTsCX、rTsAPP+rTsCX的免疫保护效果。此外，还观察不同免疫组小鼠感染后7d小肠组织与46d肌肉的病理变化。 10.统计分析 Excel2010对本次实验所得数据进行整理，并使用SPSS21.0进行统计分析。根据实验方法和所用数据，相应统计方法的类型选择，包括T检验、单因素方差分析和卡方检验。检验水平为α=0.05。 结果 1.TsAPP的生物信息学分析 TsAPP基因全长1887bp，编码628个氨基酸，分子量71.4kDa，PI为5.84，无信号肽，属于金属蛋白酶。结构域和酶活性位点预测结果显示TsAPP包含脯氨酸氨基肽酶、M24家族和两个肌酸酶家族的结构域，有6个酶活性位点，分别为403组氨酸(His)、416天冬氨酸(Asp)、427天冬氨酸(Asp)、494组氨酸(His)、509谷氨酸(Glu)、539谷氨酸(Glu)。用BioEdit软件将TsAPP与其他12个物种的氨基肽酶P进行序列比对，发现其与旋毛虫属其他种旋毛虫同源性较高。用MEGA7.0软件对20个物种的氨基肽酶P进行比对及系统进化分析显示，旋毛虫与成囊型旋毛虫有较近的进化地位。 2.rTsAPP的克隆表达及抗原性分析 测序结果表明TsAPP基因与GenBank上TsAPP的基因序列具有98％相似性。SDS-PAGE结果显示，在分子量为69kDa处出现一条蛋白带，可溶性分析表明rTsAPP在沉淀中较多。Westernblot结果显示，rTsAPP可以被旋毛虫感染鼠血清、抗rTsAPP血清及His单抗识别，证明rTsAPP具有较好的抗原性。 3.TsAPP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位 使用RT-PCR与Westernblot技术发现，TsAPPmRNA与蛋白在旋毛虫不同虫期均有表达。IFA结果显示，TsAPP主要定位于虫体表皮、杆状体与雌虫胚胎。 4.rTsAPP酶活性测定 rTsAPP的最适反应温度为50℃，最佳pH值为9.5。Mn2+、CO2+和Fe2+均提高了rTsAPP的酶活性，且效果为Mn2+＞CO2+＞Fe2+。金属蛋白酶螯合剂EDTA对rTsAPP的酶活性有抑制作用，而其他蛋白酶抑制剂对酶活性没有明显影响。rTsAPP对H-Ala-Pro-OH的水解作用符合米曼氏动力学，Vmax为220μmolmin-1mg-1，Km为31.82mM。 5.rTsAPP与血红蛋白Hb的结合 Far-western结果显示，抗rTsAPP及rTsAP血清均可识别猪Hb的5个条带(63.4、55.7、29.9、23.6、15.7 kDa)，感染旋毛虫小鼠血清可识别猪Hb的2个条带(29.9、15.7 kDa)，但猪Hb不能被正常鼠血清识别，表明rTsAPP能够与猪Hb蛋白特异性结合，提示TsAPP可能与旋毛虫摄取营养有关。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明，重组蛋白能与血红蛋白结合，OD值与血红蛋白浓度相关(r=0.922，P＜0.01)，并随着血红蛋白浓度的增加而增加(F=256.527，P＜0.001)。OD值也与rTsAPP的孵育浓度相关(r=0.977，P＜0.05)，并随着rTsAPP浓度的增加而增加(F=84.564，P＜0.001)。IFA结果以后显示，rTsAPP可与小鼠Hb特异性结合。 6.抗rTsAPP血清介导的ADCC对新生蚴的杀伤作用 当免疫血清浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800时，抗rTsAPP血清ADCC介导的新生幼虫的死亡率分别为33.9％、28.8％、15.1％、11.9％、和7.7％;抗rTsCX血清ADCC介导的新生幼虫的死亡率分别为34.9％、33.0％、19.5％、11.3％、和7.1％;联合免疫组血清介导的新生幼虫的死亡率分别为40.4％、35.1％、25.0％、14.9％、和9.3％;不同血清浓度下三个免疫组相比于佐剂血清组及PBS血清组的新生幼虫死亡率有统计学意义(F1∶50=116.806，P=0.0001;F1∶100=31.936，P＜0.005;F1∶200=94.964，P＜0.005;F1∶400=63.131，P＜0.005)。且杀伤率随着血清浓度的升高而升高，存在剂量依赖性(rrTsAPP=0.970,P＜0.01;rrTsCX=0.976,P＜0.01;rrTsAPP+rTsCX=0.994,P＜0.01)同时杀伤率也随着时间的增长而升高(F24h=65.837，P=0.0001;F48h=91.978，P＜0.005;F72h=，119.039,P=0.0001)。 7.rTsAPP与rTsCX联合免疫引起的体液免疫应答 rTsAPP、rTsCX以及二者联合免疫小鼠，随着免疫时间的延长，各个不同免疫组血清中抗体水平逐渐升高，在免疫后2、4、6周3个免疫组的IgG水平显著高于ISA201与PBS对照组(F=585.162，P=0.0001)。此外，免疫组的IgG1及IgG2a水平也显著升高(F=16.733，P=0.0001;F=30.062;P=0.0001)，但IgG1水平显著高于IgG2a(t4w=5.053，t6w=2.096;P=0.0001)，表明rTsAPP免疫诱导的是以Th2型为主的免疫应答。此外,3个免疫组在免疫后6周肠道总的与特异性的sIgA水平亦明显高于佐剂与PBS对照组(F=87.236，P=0.0001)。细胞因子检测结果表明，3个免疫组免疫后IFN-γ与IL-4水平与免疫前相比均显著升高(F=20.032，P=0.0001;F=8.250，P=0.001)，也明显高于佐剂组与PBS组(F=62.031，P=0.001;F=37.918，P=0.001)。攻击感染后2周IFN-γ与IL-4水平继续升高。结果表明，rTsAPP、rTsCX或两者联合免疫小鼠均诱导了全身性与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型的免疫应答。 8.rTsAPP与rTsCX联合免疫小鼠所引起的免疫保护效果 与PBS组及佐剂组相比较，rTsAPP、rTsCX以及两种蛋白联合免疫小鼠攻击感染后7d，肠道成虫减虫率分别为44.69％、49.22％、63.99％(F=79.278，P=0.0001)，2种蛋白联合免疫组的成虫减虫率明显高于单个蛋白免疫组(F=18.881，P=0.0001)。两种蛋白联合免疫组雌虫长度明显短于PBS组(F=7.439，P=0.0001)。免疫小鼠感染旋毛虫小肠病理切片HE染色结果显示，3个免疫组肠上皮杯状细胞数明显少于佐剂和PBS组(F=71.843，P=0.0001)，肠绒毛宽度显著小于2个对照组(F=36.608，P=0.0001)，表明rTsAPP、rTsCX以及两种蛋白联合免疫均减轻了旋毛虫攻击感染后的肠道炎症反应。 与PBS组及佐剂组相比较，rTsAPP、rTsCX以及两种蛋白联合免疫小鼠攻击感染后46d，肌幼虫减虫率分别为50.09％、54.78％和68.50％(F=312.421，P=0.0001)，2种蛋白联合免疫组的肌幼虫减虫率明显高于单个蛋白免疫组(F=33.474，P=0.0001)。表明rTsAPP及rTsCX免疫小鼠对旋毛虫幼虫的攻击性感染具有明显的免疫保护作用。咬肌组织切片显示，佐剂组及PBS组小鼠幼虫囊包周围有较明显的病理学变化，即囊包周围有大量的炎症细胞(F=35.518，P=0.001)，而蛋白组相对于PBS组囊包周围炎症细胞浸润明显减少(F=41.592，P=0.0001)。 结论 1.表达纯化出了重组旋毛虫氨基肽酶P(rTsAPP)。 2.TsAPP在旋毛虫发育的各个时期(肌幼虫、肠道感染性幼虫、成虫、新生幼虫)均有表达，主要分布于虫体皮层及雌虫胚胎。 3.rTsAPP具有天然氨基肽酶P的酶活性。 4.rTsAPP能够与猪及小鼠血红蛋白特异性结合。 5.rTsAPP的单独免疫以及与rTsCX的联合免疫诱导了全身性与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型免疫应答及明显的免疫保护效果。
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