摘要
背景: 糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，而高血糖是体内胰岛素分泌缺陷或胰岛器官生物作用受损的表现。长期血糖的增高，会导致大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等部位。糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。糖尿病溃疡就为其中一种较为严重的并发症。伤口愈合受阻是糖尿病溃疡的根本原因，这给病人带来巨大的伤害，甚至有截肢的风险。糖尿病病人伤口溃烂一方面表现为:血液中含糖量过高，大大降低了细胞携带氧气与各类营养物质的能力，细胞活力降低;另一方面就是活力降低的细胞免疫力不如正常细胞，难以抵抗细菌的侵袭，致使细菌在伤口疯狂繁殖，甚至产生致密的细菌被膜—生物膜结构，加重伤口溃烂。严重的细菌感染也是致命性的因素，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)是临床上最为常见的细菌，特别是MRSA对很多常见抗生素都产生抗药性，这就加大了治疗伤口感染的难度。 临床上常以口服降糖药或注射胰岛素与局部使用生理盐水冲洗的方法治疗糖尿病伤口溃烂，但效果并不显著。造成这种现象的原因有以下几点:第一，在细菌接触到伤口后，疯狂繁殖形成致密的细菌生物膜结构，将游离细菌包裹在其中，即使使用抗生素冲洗也没法达到预期成效，抑菌效果大大降低;第二，由于抗生素的滥用，细菌通过自身调节变异产生耐药性，导致临床使用的多种抗菌药的抗菌效果大打折扣。第三，高糖伤口处的细胞活力不及正常细胞，引起伤口愈合缓慢。因此，加速伤口愈合应该从伤口的实际需要出发，不仅应清除伤口处的细菌，消灭细菌感染，更要提高患处组织的活力，新的治疗方案亟待探索。 在无机纳米酶领域新兴的硫化铁纳米酶，因其高效的催化性，优良的生物安全性以及简易的合成过程，受到广泛关注。本课题组近期研究表明硫化铁具有多重生理功能，包括抗菌，抗肿瘤，降低免疫应激等。而我们课题组前期研究发现，硫化铁纳米酶在一定条件下可以产生硫化氢气体。硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化碳，一氧化氮后的第三种气体信号分子，在机体的生理病理活动中发挥重要作用。据报道，硫化氢具有舒张血管，降低血压;提高血流量，减轻缺血再灌注引起的心肌损伤;通过激活血管内皮细胞生长因子受体，促进内皮细胞迁移和血管新生等功能。据相关文献记载，若将纳米酶加入中药修饰后，制得的纳米酶的医理作用会增强，疾病治疗效果会提升，比如修饰了黄连素，葛根，姜黄素等中药成分，纳米酶可以更具有针对性地治疗癌症，肠炎，龋齿等疾病。 基于以上研究，本文合成了三种非晶型的硫化铁纳米酶，包括以L-半胱氨酸(L-Cysteine，cys)为硫源的纳米硫化铁和两种大蒜素为硫源的纳米硫化铁。通过局部添加硫化铁纳米酶，在硫化铁纳米发挥高效杀菌功能的同时，利用生理浓度的还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)还原硫化铁纳米，诱导无机纳米硫化铁发生氧化还原反应释放硫化氢，既能杀灭伤口感染细菌，又可恢复伤口组织的细胞活力，发挥双重功能，加速伤口恢复。 目的: 在抗生素滥用的后时代，在糖尿病发病率居高不下的现时代，寻找一种既有效又低廉的减轻糖尿病溃烂痛楚的医疗手段尤为迫切。本论文在本课题组对硫化铁纳米酶的研究基础上，进行了改进，通过增加新的原料聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone，PVP)以及更改各原料配比，采用溶剂热法合成了三种不同硫元素来源的无机硫化铁纳米酶(以下简称p-nFeS，p-DADS-nFeS，p-DATS-nFeS，p代表pvp)，发现这些纳米酶均具有良好的杀菌效果，能够与细菌及生物膜高效结合，裂解细胞壁并降解细菌DNA，彻底杀灭细菌，并且在生理浓度GSH的诱导下可以稳定地释放内源性气体信号分子硫化氢，发挥促进伤口处细胞迁移，提高创面愈合的功能。这种针对性疗法可以有效的加快糖尿病创面的愈合进程，降低病人的痛楚，为改善糖尿病伤口愈合提供新的思路和方法。 方法: 第一章对以L-半胱氨酸为硫源的硫化铁纳米酶(p-nFeS)抗菌及提高细胞迁移能力的研究 本章我们通过溶剂热合成法制备p-nFeS，通过扫描电子显微镜及透射电子显微镜对纳米的结构和尺寸进行观察;通过酶反应动力学，我们检测了p-nFeS纳米的拟过氧化物酶和拟氧化物酶活性;我们选用临床常见的感染菌S.aureus和MRSA测试硫化铁的抗菌效果，使用生物扫描电镜以及激光共聚焦显微镜观察经纳米作用之后的细菌细胞壁结构及活死状况;并对细菌内部死亡机制进行了探究，主要包括:观察细菌DNA降解情况、细菌发生脂质过氧化、细菌内部ROS产生情况;通过生理浓度的谷胱甘肽溶液的还原，我们测定了纳米释放硫化氢的效率以及选用人表皮永生化细胞(Hacat)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行了细胞划痕损伤修复实验，观察纳米释放的硫化氢对细胞迁移能力的影响。 第二章以大蒜素为硫源的硫化铁纳米(p-DADS-nFeS/p-DATS-nFeS)对糖尿病小鼠慢性伤口感染的治疗研究 大蒜素是一种提取自我们日常生活中常见的蔬菜，如大蒜、洋葱的中药，已被证明具有消炎，降胆固醇，降血脂，降血压的药用价值。有关研究还表明，中药大蒜素不仅具有抗菌消炎的作用，还是一种性质优良的硫化氢供体。于是，我们设想将纳米酶中的硫源由上章中的半胱氨酸替换为中药大蒜素，以期增强纳米的治疗效果。我们遵照硫元素守恒的原则，依旧使用溶剂热合成法合成大蒜素硫化铁纳米酶，通过透射电子显微镜观察了两种大蒜素纳米的形态;选用MRSA菌种进行了抑菌实验;使用亚甲基蓝褪色法检测了纳米的过氧化物酶活和氧化物酶活;使用亚甲基蓝比色法测试了纳米释放硫化氢的状况;最后进行动物实验验证，选取4到6周龄的BALB/c小鼠，通过一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)，造模成Ⅰ型糖尿病小鼠，在其背部制造以MRSA为感染源的伤口。后期予以不同浓度纳米药物治疗，观察统计实际伤口愈合情况。 结果: 第一章:本章成功合成了以L-半胱氨酸为硫源的硫化铁纳米酶(p-nFeS)。通过扫描电镜和透射电镜发现以L-半胱氨酸为硫来源的纳米硫化铁大致为不规则的薄片状混合物。通过酶反应动力学实验，我们发现p-nFeS具有过氧化物酶活和氧化物酶活;通过抑菌实验结果我们发现，当纳米浓度为100μg/mL，作用时间为60min时，其对S.aureus和MRSA的抑制率为99.99％-99.999％;通过生物扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察，我们分析得出纳米对细菌和细菌生物膜均有抑制作用;而通过探究细菌死亡的内部机制，我们发现纳米自身可以产生自由基，降解细菌DNA，诱导细菌发生脂质过氧化，引发细菌死亡。同时我们通过检测纳米释放硫化氢的能力以及观察细胞迁移实验验证了在生理浓度的GSH诱导下，p-nFeS纳米能缓慢释放硫化氢，提升细胞的迁移能力，改善恢复伤口组织愈合和能力。 第二章:本章以二烯丙基二硫醚(Diallyl Disulfide，DADS)和二烯丙基三硫醚(Diallyl trisulfide，DATS)作为硫来源合成了纳米硫化铁p-DADS-nFeS和p-DATS-nFeS。我们通过扫描电镜和透射电镜观察发现，纳米的厚度略微增加，更接近圆球型。通过X射线衍射图谱、X射线光电子能谱进一步分析，证实其均为多硫化物，其中的铁均为正二价。 通过酶反应动力学实验发现，这两种硫化铁均有过氧化物酶活和氧化物酶活，而p-DADS-nFeS的过氧化物酶和氧化物酶活性最佳。从抑菌效果来看，同样是100μg/mL的浓度，也是p-DADS-nFeS纳米酶抑菌效果最佳，它对MRSA的杀伤力达到99.999％之多。通过后续实验结果发现，p-DADS-nFeS纳米酶释放硫化氢的能力以及促进糖尿病小鼠伤口愈合的能力均强于p-nFeS纳米酶。因此我们筛选得到抑菌与促进伤口愈合最佳的双功能纳米酶:p-DADS-nFeS。
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