摘要
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是一种以肾功能快速衰竭为特征的临床危急重症，至今仍无有效治疗手段。肾小管上皮细胞(HK-2)坏死是AKI最常见的现象，HK-2细胞内过度的氧化应激及其引发的剧烈炎症反应导致其快速变性、凋亡和脱落，加剧AKI进程。此外，强烈的氧化应激和炎症反应可诱发组织纤维化，严重的纤维化组织彻底丧失功能。因此，从修复HK-2细胞损伤入手，利用纳米转运系统精准靶向、增溶减毒的优势，设计一种能高效改善氧化应激和缓解纤维化的药物系统有望解决AKI治疗的难题。本文以叶酸(FA)为靶向基团，抗炎抗氧化作用的多酚类中药单体姜黄素(Cur)和白藜芦醇(Res)为模型药物，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)和普朗尼克F127(F127)为载体，利用其高负载率、生物相容性好等特点，构建FA受体介导的纳米系统(Cur/Res@FA-F127/TPGS)实现AKI的安全、高效治疗。首先，为了实现药物的靶向递送对F127/TPGS载体进行FA功能化修饰;然后，通过薄膜水合法制备纳米系统;最后，对顺铂(CDDP)诱导的AKI体内外模型进行靶向性和药效学研究，评价该纳米系统的综合治疗效果，主要研究内容如下: 1.纳米系统的制备与表征 首先，FA-COOH和F127-OH在脱水剂二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)作用下，酯化合成FA-F127。然后，通过薄膜水合法将Cur和Res载入FA-F127/TPGS的疏水核心，得Cur/Res@FA-F127/TPGS载药胶束。最后，通过激光纳米粒度仪和透射电镜分别测定纳米系统的粒径大小和形态，结果表明Cur/Res@FA-F127/TPGS纳米系统粒径为101.5±2.3nm，且大小均一，分散性良好。 2.体外特异性靶向研究 采用异硫氰酸荧光素(FITC)荧光探针标记混合胶束，通过荧光显微镜和流式细胞仪考察HK-2细胞对纳米系统的摄取能力，结果表明纳米系统在与HK-2细胞共孵育4h后荧光强度最强，摄取率高达81.2％，游离FA阻断剂与HK-2细胞共孵育结果进一步证明纳米系统是通过FA受体介导的内吞，快速进入HK-2细胞。 3.纳米系统改善氧化应激体外药效学研究 AKI发生时，HK-2内爆发式增长的活性氧(ROS)导致线粒体通透性转换孔异常开启，使大量水和离子等进入线粒体基质，线粒体肿胀、线粒体外膜破裂，线粒体膜电位(MMP)下降，胱天蛋白酶-3(Caspase-3)凋亡信号通路激活。本文以CDDP刺激的HK-2细胞为体外AKI模型，进行纳米系统改善氧化应激体外研究。采用DCFH-DA、JC-1荧光探针考察纳米系统对ROS、MMP的影响，DCFH-DA绿色荧光强弱可反应ROS的水平，JC-1红绿荧光的相对比值可反应MMP的变化，ROS和MMP的变化均可反应细胞的损伤程度，结果表明纳米系统能有效清除ROS、稳定MMP、改善氧化应激。Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白与细胞的凋亡过程密切相关，蛋白免疫印迹实验(Western Blot)结果表明纳米系统能显著降低Caspase-3促凋亡蛋白的表达，促进Bcl-2抗凋亡蛋白的表达，通过发挥优异的抗凋亡效果改善氧化应激。 4.纳米系统体内靶向性及抗炎抗纤维化研究 氧化应激还可造成细胞膜脂质过氧化，产生过氧化产物如丙二醛(MDA)，进一步激活核因子κB(NF-κB)信号通路，促使下游炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、环氧合酶-2(COX-2)高表达造成剧烈的炎症反应。此外，AKI不及时干预治疗会诱发严重不可控的组织纤维化使组织彻底丧失功能。本文以CDDP刺激的BALB/c雄性小鼠为AKI模型，进行了纳米系统的体内靶向性及抗炎抗纤维化研究。小动物活体成像结果表明:所构建的纳米系统可特异性靶向肾脏，尾静脉注射12h后，在肾脏累积至最大浓度。采用生化法检测血清中尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)含量，黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别检测肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、MDA水平，结果表明纳米系统能显著降低代谢产物Scr和BUN含量，改善肾功能;降低脂质过氧化产物MDA含量，提高SOD的活性，改善组织中的氧化应激。SIRT1免疫组化结果证明纳米系统能有效激活SIRT1信号通路，WesternBlot和ELASA实验证明纳米系统能显著抑制NF-κB信号通路的激活，降低炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α水平。最后通过肾组织病理学的苏木精-伊红(H&E)染色和TUNEL法证明纳米系统能有效保护HK-2细胞免受CDDP的刺激凋亡和坏死。肾组织Masson、PAS、Ⅰ型胶原蛋白(CollegeⅠ)染色结果表明纳米系统能明显减少肾组织中糖原沉积，胶原纤维和CollegeⅠ蛋白过表达现象。WesternBlot结果表明纳米系统显著降低纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，延缓纤维化进程。结合以上实验证明纳米系统能通过抑制NF-κB信号通路的激活，有效降低炎性因子的表达，其还可通过降低纤维化相关蛋白的表达，延缓纤维化进程，在体内发挥优异的综合治疗效果。 综上所述，本文成功构建了一种能特异性识别HK-2细胞表面靶点的药物转运系统，体内外研究证明该纳米系统能促进Cur和Res在肾脏部位的有效蓄积，通过改善氧化应激，抑制炎症反应和组织纤维化多机制协同修复受损的HK-2细胞，为治疗AKI提供了新思路。
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