摘要
近年来，免疫治疗成为继手术治疗、化疗和放疗后第四大肿瘤治疗手段，其主要通过激活机体免疫应答杀灭肿瘤。然而，免疫治疗在临床中对实体瘤的治疗效果并不理想，这主要与肿瘤免疫原性低、肿瘤细胞易发生免疫逃逸等问题相关。基于此，本课题构建了“芽孢壳”仿生脂质体SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx。首先，将血红蛋白(Hemoglobin，Hb)及葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOx)包裹至含有JQ1的脂质体内，构建Lipo/JQ1/Hb/GOx纳米粒;其次，通过共挤压的方式将“芽孢壳”(Spore Shell，SS)包覆在脂质体表面，构建SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx给药系统。该系统表面包裹的SS具有肿瘤靶向性，可促使给药系统高效到达肿瘤部位。进入肿瘤后，GOx可在肿瘤部位发生催化反应，产生的H2O2能够与Hb中的Fe2+发生芬顿反应生成羟基自由基(·OH)，从而诱导肿瘤细胞发生焦亡并导致免疫原性死亡(Immunogenic cell death，ICD)，释放肿瘤相关性抗原(Tumor associated antigens，TAAs)。而SS又可作为佐剂与TAAs共同诱导树突状细胞(Dendritic ceils，DCs)成熟，最终高效激活细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)。此外，JQ1可下调PD-L1的表达从而增强CTLs对肿瘤的杀伤作用。具体研究如下: 1.SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx的制备与表征。首先，通过薄膜分散法制备脂质体(Lipidosomes，Lipo)，将Hb和GOx包载在含有JQ1的脂质体中，得到Lipo/JQ1/Hb/GOx;使用探超法破坏凝结芽孢杆菌芽孢得到SS;最后通过脂质体挤压器将脂质体与SS共挤压，即得SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx给药系统。紫外全波长扫描图谱、粒径及Zeta电位等结果表明，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx合成过程中各阶段产物制备成功。透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)结果显示“芽孢壳”仿生脂质体为大小均匀的球形，呈核壳结构，粒径约为110um。亚甲基蓝检测结果表明，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx能够产生·OH。 2.SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx的体外抗肿瘤活性。以小鼠乳腺癌4T1细胞为肿瘤细胞模型，考察SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx体外抗肿瘤效果。实验结果显示，载体SS@Lipo生物相容性好，且SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx抑制4T1细胞生长作用显著。细胞摄取实验结果显示，给药系统具有良好的肿瘤细胞靶向能力。C11-BODIPy581/591荧光探针检测结果显示，给药系统能够使细胞膜发生脂质过氧化。细胞焦亡实验显示，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx能够使细胞肿胀、质膜出现气泡，并增加乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)及促炎细胞因子白介素-1β(Interleukin，IL-1β)的表达。免疫实验结果表明，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx能够明显增加钙网蛋白(Calreticulin，CRT)及高迁移率组蛋白(High mobility group boxprotein1，HMGB1)的表达，能够引起肿瘤细胞发生ICD。流式结果表明，SS能够刺激DCs的成熟，并可与TAAs产生协同作用。综上，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx给药系统能够使肿瘤细胞发生焦亡，产生ICD并能与SS佐剂协同促进DCs的成熟。 3.SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx的体内抗肿瘤活性。以4T1荷瘤小鼠作为动物模型，通过尾静脉注射给药。考察给药系统在小鼠体内分布情况;检测不同治疗组小鼠的相对瘤体积及体重的变化;观察组织切片的H&E染色、免疫荧光染色及肿瘤部位免疫细胞的变化，评价SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx给药系统的抗肿瘤活性。活体成像结果显示，与其他对照组相比，该纳米系统载体具有明显的肿瘤靶向性，可延长药物在肿瘤部位滞留时间;药效学结果分析显示，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx给药系统可显著抑制小鼠肿瘤的生长，抑制肺转移;不同给药组小鼠的体重均未有下降趋势，且血常规与血生化检验结果均在正常范围内，表明给药系统生物安全性高;免疫荧光染色及流式结果表明，SS@Lipo/JQ1/Hb/GOx能够克服免疫耐受，增强机体免疫应答，从而高效抑制肿瘤的生长与转移。
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