摘要
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称大闸蟹，也称河蟹，因其风味与营养俱佳而深受消费者喜爱。但是在养殖过程中池塘溶氧昼夜变化剧烈以及水环境控制不当，使得河蟹长时间处于低氧状态，从而影响河蟹生长发育以及免疫力，导致体色差、规格小、体质下降而易继发感染致病微生物甚至死亡，最终导致回捕率低、养殖效益差。DO是河蟹养殖环境中重要的环境因子，直接影响河蟹的存活、生长、代谢、消化和免疫能力。本文采用生物化学以及分子生物学等方法，监测了河蟹池塘DO变化以及河蟹的耗氧率和窒息点，研究了低氧对河蟹生理生化和不同组织内线粒体超微结构的影响，对低氧-复氧条件下河蟹进行转录组学分析，筛选低氧诱导因子，为进一步揭示河蟹响应低氧胁迫的分子机制提供参考。主要研究结果如下: 1.耗氧量是甲壳动物呼吸代谢的重要指标，窒息点是甲壳动物耐低氧的指标，本研究测定了池塘溶解的变化，结果显示夜间池塘溶氧在较长时间内均低于4mg/L，最低可降至1.6mg/L(凌晨6:00点)，即处于低氧阶段;采用流水呼吸室法和静态呼吸室法分别测定了不同部分规格的河蟹窒息点和耗氧率，结果显示，河蟹窒息点和耗氧率与体重呈现负相关关系，大规格类别河蟹的窒息点和耗氧率显著低于小规格类别河蟹窒息点和耗氧率。河蟹夜间耗氧率均值显著高于白天平均耗氧量。 2.为了确定低氧胁迫对河蟹组织线粒体超微结构及生理生化的影响，本研究将河蟹进行低氧-复氧处理，测定河蟹体内SOD、T-ATPase、ALP、ACP活力以及MDA、LDH含量。结果显示低氧处理1h后，河蟹体内SOD、ACP活力显著性降低，MDA、LDH含量以及T-ATPase、ALP活性显著升高。低氧处理6h后，MDA含量持续升高，LDH含量以及T-ATPase、ALP活力降低，SOD、ACP活力与低氧处理1h时相当;复氧后SOD活力先升高再下降，MDA、LDH含量和ALP活力降低后上升，T-ATPase、ACP活力则在复氧阶段升高。结果表明低氧胁迫和复氧恢复都会对河蟹生理生化指标产生影响，使河蟹启动的抗氧化应激系统和优化供能代谢等调控手段。 线粒体组织显微观察显示，低氧胁迫6h后，河蟹肌肉组织线粒体数量减少，内嵴模糊且排列紊乱，部分峭消失，基质稀薄，复氧处理12h后，线粒体损伤加剧，出现空泡化;低氧胁迫6h后，河蟹鳃组织线粒体内嵴部分被破坏，复氧处理12h外膜扭曲变形，部分嵴消失，髓样变形，部分线粒体仅剩微泡或残膜。结果表明低氧会对河蟹线粒体造成严重损伤，且在复氧12h后不能恢复，损伤甚至进一步加剧。 3.为了揭示低氧-复氧下河蟹的响应分子机制，筛选差异表达基因，本研究通过高通量测序，分析低氧-复氧下河蟹某些基因的差异表达，获得49.19Gb的cleandata，组装得到27，233个新转录本的功能注释。其中26，819条序列与Nr蛋白数据库基因同源;16，299条序列注释到KEGG数据库，归类到284个代谢通路。在低氧阶段，在暴露于严重低氧1h和6h分别检测到103和251个差异表达基因。在复氧阶段，在1h和12h的复氧处理期间分别鉴定出462和673个差异表达基因。低氧应激对低氧6h组的57条通路有显著影响。其中，前三个基因富集最为显著的途径是“PPARsignalingpathway”，“Gapjunction”和“Phototransduction-fly”。在复氧阶段，前三个基因富集最为显著的途径是“ECM-receptorinteraction”，“Lysosome”和“Phagosome”。17个差异基因qRT-PCR验证结果与测序结果上下调趋势一致，证明了转录组测序的准确性。 4.根据全长转录组测序结果，筛选鉴定出河蟹低氧应答的关键基因Hif-1α、Hif-1β，cDNA全长分别为5，377bp、2，868bp，三个ORF分别编码1，057和551个氨基酸残基;两个基因均包含一个HLH结构域和两个PAS结构域。对可以与河蟹Hif-1基因发生互作的蛋白进行分析，共鉴定出476个蛋白(包括71个DEGs)可能以直接或间接的方式与河蟹Hif-1发生相互作用，GO富集分析表明，绝大多数路径都与细胞进程有关，例如“oxidoreductaseactivity”、“transferaseactivity”和“smallmoleculebinding”。表明低氧胁迫激活了河蟹体适应低氧的一系列生理活动。 此外，对水草生长良好的池塘和无水草池塘中河蟹的Hif-1α、Hif-1β基因表达差异以及组织分布进行研究。结果显示，河蟹Hif-1α、Hif-1β在胃、肝、肠、鳃、眼柄、心脏、肌肉、血液中均有表达，在心脏、血液、肌肉中表达量相对较高，眼柄中表达量最少。与有水草池塘河蟹相比，无水草池塘河蟹Hif-1α、Hif-1β表达量均有显著提高，Hif-1α在肝胰腺、肌肉和鳃中表达量分别提高了2.22、0.99、0.69倍，Hif-1β在肝胰腺、肌肉和鳃中表达量分别提高了5.76、3.34、2.24倍。结果表明，无水草环境会对河蟹机体产生影响，导致河蟹启动应对低氧环境的分子调节机制。
NETL