摘要
表观遗传是指DNA不发生变化而基因表达或细胞表型发生可遗传变化的现象。表观遗传一般发生在有丝分裂或减数分裂过程中，能够通过控制基因的表达和转录来调控生物体的胚胎形成和基因组印记等过程。大量研究表明，人类细胞表观遗传水平异常可导致发育障碍、老年痴呆和癌症等疾病的发生。所以，表观遗传可以为重大疾病的诊断、治疗和预防提供新的机遇。 研究者已经研究了多种生物表观遗传的分子学基础，并且发现了一系列表观遗传生物标志物，其中主要包括DNA甲基化、DNA羟甲基化、非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)、RNA甲基化和组蛋白修饰等。准确检测这些表观遗传生物标志物，不仅对表观遗传学相关的生物化学研究具有重要意义，而且对癌症的诊断、预后和治疗也具有极大价值。 用于表观遗传生物标志物检测的传统方法主要包括印迹法、同位素测定法、质谱法和免疫吸附法。但它们存在灵敏度较低、耗时长、样品量大、需要放射性物质、涉及昂贵的仪器、样品制备复杂、操作耗费劳力等不足。 本文以DNA甲基化、DNA羟甲基化、ncRNA、RNA甲基化为研究对象，结合量子点(quantum dot，QD)、磁珠(magnetic bead，MB)等新型材料与核酸扩增、荧光光谱分析、单分子检测等技术，发展了一系列操作简单、灵敏度高、选择性好的表观遗传生物标志物检测方法。具体研究内容如下： 1、发展了一种基于单个QD的纳米传感器，该传感器可以利用三环连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer， FRET)，实现超灵敏检测胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(cytosine/guanine dinucleotides，CpG)岛和非CpG岛的DNA甲基化。我们设计了两组DNA探针(X和Y，X’和Y’)，在热稳定DNA连接酶存在时，探针X和Y可以与甲基化的DNA相邻杂交来获得连接的XY产物，该连接的XY产物可以作为探针X’和Y’的模板来产生X’Y’产物。所得到的X’Y’产物又可以作为模板来连接探针X和Y，导致继续产生XY产物。在热变性条件下，不断的相邻杂交将诱导三环LCR扩增产生大量的XY产物。随后我们将XY产物与捕获探针和报告探针杂交，形成三明治杂交物。该杂交物可以聚集在605QD表面来获得605QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构，从而诱导从605QD到Cy5的高效FRET和Cy5信号的发射。该纳米传感器可以在单个5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)分辨率下检测DNA甲基化，且检测限(limit of detection，LOD)低至1.00×10-17M，动态范围可达7个数量级。此外，该纳米传感器可以区分低至0.01%的甲基化水平，还可以检测到人类肺癌细胞中的DNA甲基化，在准确的表观遗传学评估和早期癌症诊断方面具有巨大的潜力。 2、发展了一种无标记的荧光生物传感器，利用5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)选择性氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)、随后转化为尿嘧啶(uracil，U)的原理，结合连接介导的滚环扩增(rolling circle amplification， RCA)技术，实现了对5hmC和5mC的区分。5hmC-DNA先被高钌酸钾(KRuO4)氧化，然后被重亚硫酸盐/氢氧化钠(NaOH)处理，5hmC将会变成U。随后该探针作为挂锁探针连接的模板来启动等温RCA反应，生成大量长度不同的单链DNA片段，最终使用SYBRgreenII荧光染料进行定量。该方法灵敏度高，LOD为3.48×10-14fM，甚至可以在混合物中区分低至0.01%的5hmC-DNA，并且能够在血清样本分析中表现出良好的性能。该实验为超灵敏的5hmC检测开辟了一条新途径，对甲基化/去甲基化调控的研究具有重要意义。 3、发展了一种基于单个QD-FRET的纳米传感器，利用无铜和无酶循环点击化学介导LCR的原理检测microRNAs(miRNAs)。我们设计了两种分别用叠氮化物(azide，N3)和二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)修饰的DNA探针(DNA探针1和2)，在miRNA存在的情况下进行无铜和无酶点击化学反应，并产生探针1-2连接产物。我们又设计了另外两种用N3和DBCO修饰的DNA探针(DNA探针3和4)，使得与探针1-2连接产物杂交并产生探针3-4连接产物。然后，探针1-2连接产物和探针3-4连接产物都能作为模板，引发循环点击化学介导的三环LCR扩增，扩增获得的产物被基于单个QD的FRET纳米传感器检测。该实验不涉及任何逆转录、铜催化剂和连接酶，灵敏度高(LOD为3.87×10-17M)、特异性强，甚至可以区分单碱基错配。此外，该实验还可以进一步在单个细胞水平上检测miRNA-155，并且可以区分miRNA-155在健康人和非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者组织中的表达水平。 4、发展了一种单分子计数生物传感器，利用N6-甲基腺苷(methylation of adenosines at the N6position，m6A)修饰敏感的核酸内切酶和末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)介导的扩增，超灵敏检测信使RNA(messenger RNA， mRNA)的m6A。m6A位点阻断了毒素蛋白(MazF)内切酶对目标序列的切割，导致目标序列可以与捕获探针和引物探针杂交，形成三明治杂交结构。接下来，MB与三明治杂交结构进行结合，然后引入TdT酶，驱动大量带有荧光基团的单核苷酸高效聚合到三明治杂交结构上进行信号扩增反应，最后经过MB的分离、核酸外切酶I(exonuclease I，Exo I)的消化，实现对荧光基团的单分子计数检测。该方法特异性好、灵敏度高，LOD为2.24×10-17M，并且具有在1.00×10-16M到1.00×10-9M7个数量级之间的大动态范围。该方法可以从m6A-mRNA和对照mRNA混合物中区分出低至0.01%的m6A-mRNA水平，甚至可以准确地对血清样品中和3个细胞中的m6A-mRNA水平进行量化。该实验为超灵敏m6A检测开辟了一条新途径，对甲基化/去甲基化调控的研究具有重要意义。
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