摘要
背景： 孤独症(Autism, ASD)，又称自闭症，指在婴幼儿时期表现出持续性的社会交往障碍和重复刻板的行为模式的功能障碍性疾病。ASD是一种神经系统发育障碍性疾病，其发病机制复杂，同时受到遗传因素和环境因素，以及它们之间的相互作影响。证据显示，神经网络异常整合，胶质细胞异常活化，兴奋性突触传递和抑制性突触传递比例(excitatory/inhibitory ratio)失衡所引起的局部神经网络功能亢进与ASD的发生密切相关。尤其突触传递功能障碍是伴随着ASD发生的关键的神经生理改变。产前丙戊酸钠(VPA)暴露能够诱导子代表现出ASD样行为，该模型是基础和临床前研究中广泛应用的ASD药理模型，对ASD发病机制的研究及干预药物的筛选具有重要的意义。VPA作为一种非选择性去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)，在妊娠期及发育早期能够影响神经系统的发育和突触功能相关的关键基因的表达。然而，产前VPA暴露诱导子代表现ASD样行为表型的机制尚不完全清楚，尤其是基于不同脑区的调控机制仍有待进一步研究。 KLF4(Kruppel-like factor 4)是一种Kruppel样转录因子蛋白家族的锌指蛋白转录因子。研究报道，在体外胚胎干细胞的培养条件下，KLF4能够联合Sox2，Oct4和c-Myc等三个转录因子共同诱导小鼠胚胎或成体成纤维细胞转化为多能干细胞(induced pluripotent stem, Ips)，这提示它们在胚胎发育和细胞的增殖分化过程中发挥重要的调控作用。近年来的研究表明，KLF4也参与神经新生、神经损伤后的修复，小胶质细胞活化介导神经炎症等过程。KLF4能够通过结合stat3的磷酸化位点并抑制stat3介导的下游的转录活动，促进树突棘新生，影响轴突再生，说明stat3是KLF4在神经系统中发挥调控作用的关键下游靶因子。这些结果提示，KLF4可能参与神经发育障碍类疾病的神经生理调控。然而，目前未见有关KLF4与ASD的关系的报道，尤其是其在产前VPA暴露诱导的子代ASD模型中的调控作用的报道。基于以上背景，本研究拟对KLF4在产前VPA暴露诱导的子代ASD模型的调控作用，以及KLF4对ASD样行为的调控机制展开探讨。 目的： 从整体水平验证VPA模型的表面效度；通过研究社交活动诱导的内侧前额叶皮层(mPFC)和海马(HP)脑区的神经元活动的变化探讨VPA模型的社交障碍可能的神经生理机制；探讨KLF4在VPA模型中的调控作用和mPFC的KLF4表达水平对ASD样行为的影响及可能的分子机制。基于以上研究，旨在对ASD样行为，尤其是社交障碍发生的机制提供补充，并为ASD发病机制的研究和干预药物的筛选提供一个可能的分子靶点。 方法： 于胚胎期12.5日(E12.5)给予怀孕的雌鼠单次500mg/kg剂量的VPA或相同剂量的生理盐水腹腔注射，构建产前VPA暴露诱导的子代ASD模型。发育至21天(P21)，分别对子代幼鼠进行旷场实验、埋珠实验和三箱社交实验对VPA模型的行为表型进行验证，通过免疫组织化学染色的方法，对mPFC和HP不同亚部位在社交活动后的c-Fos(神经元活化的蛋白标记)表达量进行比较，探讨VPA模型的社交障碍发生的可能的神经生理机制。 基于已成功构建的VPA子代大鼠模型，通过免疫印迹方法，对KLF4，Sox2，Oct4和c-Myc在P21子代大鼠的mPFC，HP，杏仁核(Amyg)和纹状体(Stria)蛋白表达水平进行测定。通过免疫荧光染色的方法，分别对发育至P1，P7，P21和P35四个发育时间点的mPFC神经元蛋白标记(Neun)，星形胶质细胞蛋白标记(GFAP)和小胶质细胞蛋白标记(Iba1)的荧光表达量进行比较，对KLF4在VPA模型中的作用及可能的机制进行探讨。 通过脑立体靶向mPFC注射干扰/过表达KLF4表达的慢病毒，构建mPFC低表达和高表达KLF4的动物模型，待病毒转染表达后，通过旷场实验、筑巢实验、埋珠实验、三箱社交实验对小鼠的ASD样行为表型进行探究，通过免疫印迹实验对KLF4表达，及其下游的pstat3/stat3蛋白表达水平进行验证；通过免疫印迹和免疫荧光染色的方法对对Neun，GFAP和Iba1的蛋白和荧光表达进行研究，利用免疫印迹实验对AMPAR受体亚基1(GluA1)，突触素I(Synapsin I)，突触后致密蛋白95(PSD95)等兴奋性突触相关蛋白及谷氨酸脱羧酶65(GAD65)，谷氨酸脱羧酶67(GAD67)，γ-氨基丁酸A受体α1亚型(GABAAα1)等GABA能抑制性传递相关蛋白的表达量的变化进行测定。 结果： 1.对于产前VPA暴露诱导的子代ASD模型，社交活动刺激其mPFC的ILcFos表达显著低于对照组，而比较VPA模型组和SAL对照组的HP的CA1,CA3和DG，c-Fos的表达量无显著差异，说明产前VPA暴露通过破坏mPFC神经元对社交信号的响应能力进而引起社交障碍。 2.转录因子KLF4在发育至P21的产前VPA暴露诱导的子代ASD模型的mPFC表达显著升高，而在HP，Stria和Amyg部位无此变化趋势，其他诱导体外重编程的转录因子Sox2、c-Myc、Oct4的表达也无此变化趋势，P21是VPA模型mPFC的Iba1和GFAP表达增加的关键时间点，VPA模型组mPFC的GFAP表达在发育至P35仍多于正常对照，而Iba1无此趋势。说明mPFC的KLF4可能通过影响胶质细胞表达及活化参与产前VPA暴露诱导的子代ASD的发生。 3.mPFCKLF4表达水平异常能够引起小鼠社交行为障碍。mPFC的KLF4过表达抑制社交活动诱导的ILc-Fos表达增加。mPFC的KLF4过表达上调Iba1和GFAP的表达量，干扰mPFCKLF4表达下调Iba1和GFAP的表达量。mPFCKLF4过表达抑制GluA1的表达，上调GAD65和GABAAα1的表达水平。 结论： 1.产前VPA暴露通过破坏mPFC神经元对社交信号的响应能力进而引起社交障碍。 2.mPFCKLF4可能通过影响胶质细胞表达及活化参与产前VPA暴露诱导的子代ASD的发生。 3.mPFCKLF4能够影响社交行为。mPFC的KLF4上调Iba1和GFAP，抑制GluA1的表达，上调GAD65和GABAAα1的表达水平，进而破坏兴奋性/抑制性传递。
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