摘要
菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种专一寄生在菰(Zizania latifolia)体内的活体真菌。与大多数病原菌侵染寄主植物造成的病害不同，菰黑粉菌与菰形成了一种特殊的共生关系，抑制菰植株抽穗开花，并刺激其茎基部膨大形成鲜嫩可口的茭白。茭白是东南亚常见的水生蔬菜，在我国广泛种植，尤以江浙的太湖流域栽培最多，产业集中度较高。前人研究表明，生长素在植物-微生物互作中发挥着重要的作用，微生物和寄主植物均具有合成吲哚乙酸(IAA)的能力。茭白肉质茎膨大过程中IAA含量变化明显，且在离体培养的菰黑粉菌的培养液中也发现了IAA。然而茭白生长发育过程中菰黑粉菌合成的IAA是否起作用，及其生长素合成途径中相关酶在菌丝形成和茭白膨大时的功能尚未明确。本研究利用生物信息学方法在菰黑粉菌基因组(INSDC:JAAKGJ010000000)中共鉴定得到10个生长素生物合成过程中相关酶，对其蛋白质理化性质、进化关系、基因结构、保守功能域(motif)进行分析，同时检测了这些基因在性亲和菌株融合菌丝发生时和茭白生长发育过程中的表达差异;进一步构建了菰黑粉菌基因敲除载体并通过PEG介导的同源重组法获得了缺失突变菌株ΔUeiad1，为研究UeIAD1基因的功能奠定基础。主要结果如下: 1.菰黑粉菌中IAA合成途径的吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvate，IPA)途径和吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide，IAM)途径共有10个相关酶编码基因，其蛋白分子量在33.48～66.24kDa，基因结构比较保守，与玉米黑粉菌中相关酶基因亲缘关系最近。在IPA途径中，2个色氨酸氨基转移酶(Trp aminotransferase，TAM/TAA)、1个吲哚3-丙酮酸脱羧酶(Indole-3-pyruvate decarboxylase，IPDC)和4个吲哚-3-乙醛脱氢酶(Indole-3-acetaldehyde dehydrogenase，IAD)分别具有第一类和第二类转氨酶(Aminotran_1_2)、硫胺素焦磷酸酶(Thiamine pyrophosphatase，TPP)和醛脱氢酶(Aldedh)的特征结构域。在IAM途径中，2个色氨酸-2-单加氧酶(L-amino acid oxidase，IaaM)和1个吲哚-3-乙酰胺水解酶(N-acylethanolamine Amidohydrolase，IaaH)，分别含有氨氧化酶(Amino oxidase)和酰胺酶(Amidase)的特征结构域。 2、利用单孢分离技术从茭白中分离得到了菰黑粉菌MT型的3个单倍体菌株:UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24，进一步研究发现UeYD-3MT10和UeYD-3MT12组合(UeYD-3 MT10-12)、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24(UeYD-3 MT12-24)组合均能够发生单倍体性亲和菌株的融合，且前者的产生的菌丝的长度是后者的2倍左右，同时通过qRT-PCR分析了融合菌丝形成时IAA合成途径相关酶基因的家族成员表达，结果显示筛选出的UeIAD1基因在菌丝生长较快的组合中的表达量显著升高。表明在离体培养条件下，菰黑粉菌融合菌丝的快速生长可能与生长素有关，UeIAD1基因可能参与调控菌丝生长。 3、对茭白生长发育过程中不同阶段时内源激素含量和菰黑粉菌生长素合成相关酶基因表达进行分析，结果显示茭白肉质茎起始形成期生长素IAA含量剧烈升高，快速膨大期逐渐下降但仍维持了较高的含量水平，膨大的后期IAA的含量最低;与之相应的菰黑粉菌TAM、IPDC、IAD、IaaM和IaaH基因家族成员的表达在茭白起始形成时不变化或略有下降，此后逐渐升高达到峰值，在茭白膨大的后期呈下降趋势，其中UeIAD1基因在茭白快速膨大期表达量升高的倍数最多，且维持的时间最长。IAA在肉质茎起始膨大时起关键作用，但菰黑粉菌合成的IAA可能不直接诱导肉质茎的起始膨大，可能与维持茭白肉质茎内IAA含量水平有关。 4、建立了菰黑粉菌的遗传转化体系，28℃摇培36～48h的菌体，以0.8M的山梨醇作为稳渗剂，用2％崩溃酶+1.5％裂解酶的酶液，于30℃，85rpm，酶解3～4h制备的菰黑粉菌原生质体得率最高。构建了基因敲除载体并通过PEG介导的同源重组法获得了UeIAD1的基因缺失突变菌株。
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