摘要
酸度是果实中非常重要的品质性状，酸度的高低会直接影响果实的风味及其加工品质。苹果果实中含有大量的有机酸，目前已经检测出有16种有机酸，其中苹果酸是最主要的有机酸，占到总酸量的80％以上，直接决定果实的酸度，影响果实的风味。 苹果酸代谢是一个涉及合成、降解和转运的复杂生物过程。其中，苹果酸的合成可以通过细胞质糖酵解、三羧酸循环、卡尔文循环和乙醛酸循环等多种代谢途径实现。高浓度的苹果酸通过主动运输储存在液泡中。液泡型质子泵(V-ATPase和V-PPase)、苹果酸转运蛋白(ALMT)是苹果酸转运进入液泡的关键。液泡型质子泵在液泡内外建立跨膜的电化学势梯度，驱动质子泵入液泡中，使液泡酸化，并为苹果酸转运蛋白提供能量。由于液泡中的酸性环境，苹果酸跨过液泡膜后会立即被质子化，有效地将苹果酸捕获到液泡中。 转录因子位于液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白的上游，广泛参与调控苹果酸的合成与转运。其中，MYB、bHLH和WD40蛋白通过形成MBW复合体，转录激活编码液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白的表达，从而影响苹果酸在液泡中的积累。在苹果中，R2R3-MYB转录因子MdMYB73通过直接与液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白相关基因的启动子结合，促进苹果酸的积累。另外，MdCIbHLH1与MdMYB73相互作用，增强MdMYB73对下游相关基因的转录活性，进一步促进苹果酸的积累。 植物体内苹果酸的积累受到矿质营养、温度和灌溉方式等外界环境因素和农艺措施的影响。氮素作为植物生长发育过程中所必需的大量营养元素，影响植物体内苹果酸的积累。生产中，果树种植者为了获取较高的产量和经济效益，滥用化肥(以氮肥为主)，导致果实品质下降。过量施加氮肥会降低苹果果实中苹果酸的含量，但是具体机理尚不清楚，这是本研究拟解决的科学问题。 本研究以苹果材料为研究对象，探索了硝态氮影响苹果酸积累的分子机制。主要结果如下： 1、高浓度的硝态氮抑制苹果中苹果酸的积累。用不同浓度的硝态氮(0、0.5、5 mM)处理苹果愈伤组织、苹果植株和苹果果实，测定苹果酸含量。结果表明，高浓度的硝态氮显著降低了苹果愈伤组织、苹果植株和苹果果实中的苹果酸含量。进一步研究表明，高浓度的硝态氮处理后，液泡型质子泵相关基因、苹果酸转运蛋白MdALMT9以及苹果酸相关的转录因子MdMYB73的表达水平显著降低，质子泵活性也降低，液泡的pH值升高。 2、硝态氮应答基因MdBT2抑制苹果中苹果酸的积累。用硝态氮处理MdBT2转基因苹果植株，检测苹果酸含量、苹果酸相关基因的表达水平、质子泵活性以及液泡内的pH值。结果表明，MdBT2响应硝态氮抑制苹果酸的积累。 3、MdBT2与MdCIbHLH1和MdMYB73互作。通过对硝态氮应答因子MdBT2进行酵母筛库，发现MdBT2可以与调控苹果酸积累的bHLH转录因子MdCIbHLH1和MYB转录因子MdMYB73相互作用。通过酵母双杂交、pulldown以及双分子荧光互补分析，进一步验证了MdBT2与MdCIbHLH1以及MdBT2与MdMYB73的互作。 4、MdBT2促进MdCIbHLH1和MdMYB73的泛素化降解。体内和体外的降解分析表明MdBT2可以影响MdCIbHLH1和MdMYB73蛋白的稳定性。泛素化结果表明MdBT2可以通过26S蛋白酶体途径泛素化降解MdCIbHLH1和MdMYB73。 5、MdBT2通过影响MdCIbHLH1和MdMYB73，负调控MdALMT9的转录活性，抑制苹果酸的积累。通过对苹果果实进行瞬时注射以及对苹果愈伤组织进行GUS分析，发现MdBT2至少部分地通过MdCIbHLH1和MdMYB73，转录抑制MdALMT9的表达水平，降低质子泵的活性，负调控苹果酸的积累。 本研究通过MdBT2-MdCIbHLH1/MdMYB73-MdALMT9调控模块，解析了硝态氮调节苹果酸积累的分子机制，为植物中两个关键代谢产物之间的联系提供了重要线索，并且为苹果酸的翻译后修饰调控途径提供了新的思路。这些发现不仅有助于我们理解苹果酸积累的复杂调控网络，而且对指导果树分子育种和果实品质改良具有重要意义。
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