摘要
山东省地方猪种资源丰富而珍贵，其种质特性是高抗逆性、强繁殖力、鲜美肉质以及耐粗饲、耐寒，阐明这些优良种质特性的分子遗传机制是当前猪遗传育种工作的重点。此外，大量国外引进猪种被引入并开展杂交改良，严重影响了山东省地方猪种资源的纯度与种质特性的保存。因此，全面了解山东省地方猪种的遗传多样性并揭示与其他猪种的亲缘关系，是种质资源的生物多样性保护及合理开发利用的重要前提。随着高通量低成本的DNA测序技术应用越来越普遍，使得从全基因组范围内研究地方猪种的遗传变异成为可能。本研究利用SLAF简化基因组测序分析山东省地方猪种和引进猪种的遗传差异，并进行关键候选基因功能研究。具体研究内容和结果如下： 一、全基因组遗传变异检测：本研究利用SLAF-seq简化基因组测序对7个山东省地方猪种(大蒲莲猪、莱芜猪、五莲黑猪、里岔黑猪、烟台黑猪文登群、烟台黑猪莱州群、枣庄黑盖猪)和3个引进猪种(杜洛克猪、大白猪、长白猪)共计80个样本构建基因组文库并进行全基因组分子标记开发。经过质控之后，共得到1010652个SLAF标签，标签的平均测序深度为16.67×。将测序数据与数据库中的北方野猪数据联合进行SNP标记开发，共鉴定314243个具有代表性的SNP位点。 二、遗传多样性及群体结构分析：利用鉴定出的遗传变异对山东省地方猪种的遗传多样性和群体结构进行分析。六个遗传多样性指标的分析结果表明山东省地方猪种与国外引进猪种相比具有较高的遗传多样性，其中枣庄黑盖猪的遗传多样性程度最高(Ho=0.2926,He=0.3752,Nei=0.3814,PIC=0.2988,MAF=0.2852)，长白猪最低(Ho=0.2283,He=0.3259,Nei=0.3511,PIC=0.2639,MAF=0.2378)。核苷酸多态性(π)的计算结果显示，地方猪种?范围介于0.00002820~0.00003722，明显高于引进猪种(0.00002067~0.00002589)。其次群体间的分化程度评估结果显示，五莲黑猪和烟台黑猪文登群之间的群体分化指数(Fst=0.0831)最小，莱芜猪和杜洛克猪之间分化程度最大(Fst=0.5134)。系统进化树、主成分分析和群体结构分析结果显示，山东省地方猪种群体之间能够清晰独立聚类，且群体之间的亲缘关系较引进猪种相比更近。 三、选择性清除分析：经历了长期的自然或人工选择后，山东省地方猪种形成了肉质好、抗病力强等特征，因此在其基因组上可能存在这些选择作用的印迹。我们对山东省地方猪种群体进行了全基因组选择信号的检测分析。结果显示，在大蒲莲猪和莱芜猪群体基因组上分别发现162个和157个差异选择区域。其中大蒲莲猪筛选到841个正选择基因，功能分析结果显示这些基因与免疫(TNFRSF8、RAB5B、ADAM17、GNLY)、疾病(SBNO2、IFNLR1、URI1)相关，例如GNLY与抗真菌与先天性免疫有关，IFNLR1与细胞因子活性与抗病毒有关，这些基因可能与大蒲莲猪的适应性广、抗病力强性状具有潜在的关系；在莱芜猪中共707个受选择的候选基因分布在差异选择区域内，分别与肌肉生长(DMD、SKIL、EYA1 )、脂肪沉积(FITM1、ADRA2A、NR4A1)相关，如DMD与肌纤维发育和细胞骨架有关；FITM1与脂滴沉积相关。 四、IFNLR1在PRRSV感染PAM细胞中的作用：本研究首次克隆大蒲莲猪IFNLR1基因的完整CDS区，并进行相关生物信息学分析。大蒲莲猪IFNLR1的CDS区全长1578bp(MT741991)，编码525个氨基酸。进化树分析结果显示其与野骆驼和羊驼亲缘关系最近。通过荧光定量PCR对大蒲莲猪和长白猪的IFNLR1组织分布进行分析，结果表明IFNLR1基因表达存在种间及组织差异。 为了解猪IFNLR1的免疫学特性，选用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株感染猪肺泡巨噬细胞，结果显示在PRRSV感染后，猪IFNLR1mRNA的转录水平显著下调，而其配体(IFN-λ1、IFN-λ3)的mRNA表达水平呈明显上调趋势。以上结果表明Ⅲ型干扰素通路在PRRSV感染PAM细胞过程中扮演着重要角色。 为进一步明确其生物学功能，我们分别构建pcDNA3.1(+)-IFNLR1过表达质粒并合成Si-IFNLR1干扰片段，结果显示过表达猪IFNLR1能够明显抑制PRRSV的复制，上调干扰素刺激基因和抗病毒蛋白基因的mRNA水平，下调部分炎性细胞因子的表达。过表达IFNLR1后明显抑制PRRSV感染的PAM细胞增殖能力并且诱导p-STAT1表达，在干扰IFNLR1的PAM细胞中观察到相反的结果。当JAK/STAT通路抑制后，其抑制细胞增殖能力情况消失。流式结果显示PRRSV感染PAM细胞G2/M期比例明显增加。过表达IFNLR1细胞G0/G1和S期比例明显增加且G2/M期比例降低。当加入通路抑制剂JAKI后，过表达IFNLR1的PAM细胞G2/M期比例有一定程度的增加。 本研究对山东省地方猪种与国外引进猪种的遗传多样性及遗传关系等进行了探究，发现山东省地方猪种表现出较高的遗传多样性，这为地方猪种开发利用提供有价值的理论依据；猪IFNLR1基因在PAM细胞抗PRRSV感染过程中参与免疫调节作用，可以作为地方猪种高抗病力的候选基因。
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