摘要
烟草赤星病是在成熟期发生的影响我国各大烟区的主要叶部真菌病害之一，一旦大面积爆发，会造成烟叶产量质量严重下降，经济损失惨重。链格孢是烟草赤星病的病原菌。MADSbox转录因子作为真核生物体内重要的结合型转录因子，参与调控多种病原菌的菌丝生长、分生孢子产生、次生代谢和致病性等过程。 本研究从烟草赤星病菌链格孢(Alternaria alternata)中克隆了SRF型MADSbox转录因子基因AaMcm1，通过Split-marker基因敲除技术将该基因成功敲除，并对该突变体进行了回补，对链格孢中该基因的功能进行了初步研究，主要结果如下： (1)链格孢AaMcm1基因全长817bp，有两个内含子，分别位于基因的242-342bp和477-530bp处，cDNA全长663bp，编码220个氨基酸。对蛋白质序列进行分析发现在AaMcm1N端52-176个氨基酸之间存在MADS结构域，系统进化树分析表明AaMcm1基因属于SRF-Like亚类，且与小麦褐斑长蠕孢霉菌(Pyrenophora tritici-repentis)亲缘关系最近。 (2)AaMcm1基因参与调控链格孢的营养生长、菌落形态及分生孢子的产生。在PDA、MM和CM培养基上，AaMcm1基因敲除突变体的生长速度都显著降低，降低率均在70％以上，菌丝颜色变浅，在MM和CM培养基上呈白色，在PDA培养基上前7d为白色，而后逐渐变为灰色，气生菌丝变少，菌丝层变薄，菌落紧实。突变体菌丝畸形生长，链格变短，部分链格发生膨大现象，菌落边缘生长杂乱。在任何培养基上突变体都不产生分生孢子。 (3)AaMcm1基因参与调控链格孢黑色素和几丁质的产生及胁迫应答过程。AaMcm1基因敲除突变体的黑色素含量7d和20d分别降低了20.7％和15.8％，几丁质含量降低了63.3％。在盐胁迫培养基上，突变体的敏感性高于野生菌和回补体，在渗透胁迫培养基上突变体的敏感性低于野生菌和回补体。 (4)AaMcm1基因参与调控链格孢过氧化氢解毒能力和耐药性途径。相同时间AaMcm1基因敲除突变体分解的H2O2含量比野生菌和回补体少，说明突变体的H2O2解毒能力降低。在不同的药剂培养基上，突变体对王铜、咪鲜胺、菌核净、代森锰锌和TIBA表现出较低的敏感性，而对多抗霉素和CHP表现出较高的敏感性。 (5)AaMcm1基因参与调控链格孢细胞壁降解酶活性、毒素毒力和致病力。突变体的果胶裂解酶和碱性磷酸酶活性均有不同程度的提高，纤维素酶、角质酶、酸性磷酸酶和脂解酶活性均表现下降趋势。突变体基本丧失毒素毒力，完全丧失致病力。 (6)转录组分析表明，突变体与野生菌相比有1,917个差异表达基因上调，1,322个差异表达基因下调，GO分析表明上调基因参与了4,057个生物学过程，主要为细胞过程、代谢过程、生物调节、生物过程调节、应激反应，下调基因参与了2,825个生物学过程，主要为细胞过程和代谢过程、细胞过程、代谢过程、生物调节、定位、定位方法的建立。KEGG通路分析表明共有429个上调差异表达基因参与了191条信号通路，参与最多的信号通路包括真核生物核糖体合成、嘌呤代谢、细胞周期-酵母、核苷酸切除修复、DNA复制等；207个下调差异表达基因富集到170条信号通路中，主要包括碳代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢、酪氨酸代谢等。 通过本研究发现，链格孢AaMcm1基因在调控菌丝营养生长、菌落形态、分生孢子的产生、黑色素和几丁质含量、胁迫应答、过氧化氢解毒能力、耐药性、细胞壁降解酶活性、毒素毒力和致病性等方面发挥重要作用。
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