摘要
杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida, E. piscicida)是一种重要的水产动物病原菌，主要感染鱼类，严重威胁着水产养殖业的健康发展。研究证实多种细菌可以利用宿主肠道岩藻糖成分来调控其定植、致病性和代谢等多种生理功能，肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)O157:H7可以通过岩藻糖操纵子来利用岩藻糖，但E.piscicida对岩藻糖的利用、岩藻糖及岩藻糖操纵子调控E.piscicida生物学特性的机制仍不明确。本研究在前期研究的基础上，解析E.piscicida中岩藻糖操纵子关键基因fucR的作用机理。 本研究利用同源重组原理成功构建了E.piscicida岩藻糖操纵子关键基因fucR的缺失株ΔfucR，并与E.piscicida野毒株EIB202进行了一系列的比较分析。生长特性测定结果表明，L-岩藻糖能显著增加EIB202的生长速度，fucR基因缺失显著降低了EIB202利用岩藻糖的能力。半数致死量(LD50)测定结果表明，fucR基因的缺失降低了E.piscicida的致病性，EIB202的LD50值1.38×107CFU/fish，ΔfucR的LD50值为2.75×107CFU/fish。通过在含有岩藻糖和不含岩藻糖培养基中培养EIB202和ΔfucR，应用qPCR测定岩藻糖操纵子主要基因的转录水平，结合生长曲线结果分析发现，E.piscicida主要通过岩藻糖操纵子利用岩藻糖，fucR基因编码E.piscicida岩藻糖操纵子的激活子。但fucR基因的缺失并没有完全抑制E.piscicida利用岩藻糖，与在含有30mML-岩藻糖LB液体培养基中培养相比，在不含岩藻糖的培养基中，ΔfucR的岩藻糖代谢基因fucI和fucO的转录水平无显著性差异(P＞0.05)，而fucP、fucA、0292(ETAE_0292)、fucK和fucU的转录水平显著性上调(P＜0.05)，推测E.piscicida可能还具有其他利用岩藻糖的途径。 前期研究表明，E.piscicida在含有30mML-fucose的LB培养基中，其生长特性达到最佳状态，因此，我们测定了该浓度下E.piscicida野毒株EIB202和fucR基因缺失菌株ΔfucR的转录组。转录组数据结果表明，与EIB202相比，ΔfucR的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性、转座酶和脂多糖合成相关基因的转录水平均显著下调。进一步通过在含有岩藻糖和不含岩藻糖培养基中培养EIB202和ΔfucR，应用qPCR分析发现，岩藻糖上调E.piscicida的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性、脂多糖和转座酶基因的转录水平(P＜0.01)，而fucR基因本身可以上调E.piscicida的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性和脂多糖合成相关基因的转录水平(P＜0.01)，并通过控制岩藻糖的利用来上调转座酶基因的转录水平(P＞0.05)。 细菌粘附和定植能力是细菌致病力的重要指标，我们测定了EIB202和ΔfucR在罗非鱼肠道中的定植载量。6h时ΔfucR在罗非鱼肠道中定植量显著低于EIB202(P＜0.05)；12h时，定植总数与EIB202无显著性差异(P＞0.05)；并且在24h以后ΔfucR的定植量迅速降低；72h以后肠道中检测不到ΔfucR，而EIB202直到1周时才检测不到。感染定植结果表明，岩藻糖具有增强E.piscicida在罗非鱼肠道定植的作用。 鱼类细胞因子具有抗病原菌感染的作用，我们用EIB202和ΔfucR感染罗非鱼(EIB202组和ΔfucR组)，测定了白介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(INF-γ)、凝集素(lectin)和趋化因子(CXC)基因的转录水平。结果显示，两个试验组细胞因子转录水平均在6h~36h之间达到最高，而ΔfucR组的细胞因子比EIB202组转录水平降低更快，说明fucR基因缺失以后，改变了E.piscicida对罗非鱼细胞因子的诱导能力，可能与其定植能力和LPS合成能力改变有关。 总之，E.piscicida中fucR基因编码其岩藻糖操纵子的激活子，可以促进其Ⅳ型分泌系统、四环素抗性和脂多糖的合成，并通过影响岩藻糖的利用进一步促进其转座酶的合成，岩藻糖本身对E.piscicidaⅣ型分泌系统、四环素抗性、脂多糖和转座酶的合成有显著的促进作用，可能会进一步促进耐药基因的转移。本试验初步研究了E.piscicidafucR基因的功能，为细菌耐药基因传播探明新的途径，为E.piscicida致病机制和研发爱德华氏菌病的防控技术提供了新的思路和理论，具有重要研究意义。
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