摘要
J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是一种来自内源性与外源性的重组病毒，主要诱发髓细胞瘤和血管瘤，使鸡群发生严重的免疫抑制及高死亡率。p53是生物体内普遍存在的一种抑癌基因，负责调控机体稳态。但p53发生突变时，其抑癌作用丧失，能够促进肿瘤细胞增殖和转化，增加肿瘤发生的风险。本实验室在进行ALV-J致病机制的研究中发现，p53基因突变是引起J亚群禽白血病发生的重要因素之一。当细胞和雏鸡在感染ALV-J后，p53基因的转录水平会出现异常升高且突变率达60%以上。本实验室选取了p53的高突变位点区构建质粒并转染至DF-1细胞，发现C末端1011-1025位碱基缺失的p53基因能够通过激活其他癌基因(p21、bcl-2、p27、c-myc)引起细胞周期阻滞，抑制细胞凋亡以促进ALV-J复制。 但是面对复杂的机体内部环境，突变型p53在体内是否也具有促进ALV-J复制的能力尚不清楚。因此，本试验选择SPF鸡的种蛋，于鸡胚3日龄时经卵黄囊分别注射野生型(wtp53)和突变型(mtp53)p53重组慢病毒构建转基因鸡模型。利用活体GFP荧光信号成像分析、荧光定量PCR及WesternBlot证实，wtp53及mtp53在鸡体内均处于持续过表达状态，表达部位主要集中于脑、心脏、肝脏、肾脏，且ALV-J感染成功。 为了探究p53突变对机体的损害作用，本研究对过表达wtp53和mtp53鸡的体重、免疫器官指数和细胞因子表达水平进行检测。结果发现，相较于对照组和wtp53组，mtp53过表达明显抑制了鸡增重及脾脏、胸腺、法氏囊免疫器官的发育，导致血清中IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ细胞因子的表达量出现降低(P<0.05)。荧光定量分析心脏和肾脏中肿瘤相关基因表达情况，发现mtp53在整个实验过程中诱导了c-myc、bcl-2、p21、p27的高表达(P<0.001)。 为了进一步解释p53突变影响ALV-J复制、发挥致瘤作用的具体机制，对注射了wtp53和mtp53慢病毒的16日龄鸡胚的尿囊腔接种ALV-J。结果发现mtp53过表达促进了ALV-J感染鸡泄殖腔排毒量的持续升高；5w后，mtp53过表达鸡的病毒血症数值明显高于wtp53过表达鸡。在鸡10日龄、30日龄、60日龄、90日龄时定期剖杀，结果显示在感染ALV-J情况下，相较于对照组和wtp53组，mtp53过表达明显抑制了鸡增重及脾脏、胸腺免疫器官的发育，且自30日龄起，mtp53过表达抑制IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ细胞因子的表达，以90日龄最为明显(P<0.001)。组织荧光定量PCR检测结果表明，mtp53过表达显著促进了ALV-J复制(P<0.001)；病理组织学结果也证实，mtp53过表达增强了ALV-J的致瘤作用，在肝脏、肾脏、法氏囊、脑等器官内造成明显肿瘤病变，并提前了肿瘤的发生时间。荧光定量分析感染ALV-J鸡心脏和肾脏中肿瘤相关基因的表达情况，结果显示，随着鸡日龄增加和病毒增殖能力的增强，mtp53促进了c-myc、bcl-2、p21、p27的表达(P<0.001)。流式细胞术检测脾细胞凋亡情况，结果显示，相较于wtp53组，mtp53组明显抑制脾细胞凋亡，降低约10%左右。 综上所述，鸡体内mtp53过表达提高ALV-J感染鸡的泄殖腔排毒及病毒血症，显著促进ALV-J在鸡体内的复制，增强ALV-J致病性。mtp53通过抑制免疫器官发育，减少细胞因子的分泌，同时诱导肿瘤相关基因c-myc、bcl-2、p21、p27的表达，抑制脾细胞凋亡，促进ALV-J的致瘤作用。p53基因突变及过表达在ALV-J感染致瘤中发挥关键作用，为ALV-J的防控提供了新思路。
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