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TNF-α在TGF-β诱导A549细胞EMT进程中的作用

马铭泽
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TNF-α在TGF-β诱导A549细胞EMT进程中的作用

马铭泽1
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  • 1. 郑州大学
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摘要

背景与目的 肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，虽然近些年在治疗方式上有了突破性的进展，如靶向治疗和免疫治疗等，并且取得了较为满意的效果，但其仍在世界范围内发病率和病死率最高，每年约有160万人死于肺癌，总体5年生存率仅为16％，对人类的健康和生命造成严重威胁。研究表明，癌细胞的扩散和转移是导致肺癌患者预后不良的主要因素，约90％肿瘤患者的死亡均源于肿瘤细胞向其他组织、器官侵袭扩散和转移，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在此过程中起到重要作用。当肺组织上皮细胞受到粉尘、博来霉素、吸烟等因素的刺激后有可能形成肿瘤，这一过程往往伴随着EMT进程的发生，这一进程会导致细胞失去了上皮细胞的特征，表现更多的间充质细胞特征，如迁移、侵袭能力增强。 转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)在炎症、胚胎发育、上皮-间充质转化、组织修复和迁移中发挥着重要的生物学功能。在肿瘤微环境中，TGF-β通过控制细胞外基质沉积诱导肺上皮细胞向间充质细胞过渡，从而影响组织结构的改变。抑制肿瘤细胞上皮-间充质转化的机制已成为研究的热点，近来有大量研究表明，肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)在肿瘤细胞中广泛存在并且在EMT进程中起到非常重要的作用。做为重要的炎症调节因子，TNF-α在细胞稳态、免疫调节、炎症和凋亡等方面发挥了重要作用。核转录因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)是一组广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，除了参与自身免疫反应和炎症外，还参与皮肤附属器官的发生和骨的重建。大量研究发现，NF-κB信号通路可以调控细胞增殖、分化和凋亡等重要生理功能，同时与肿瘤发生发展、转移及肿瘤细胞的凋亡密切相关。非吞噬细胞氧化酶4(non-phagocytic oxidase 4，NOX4)是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶家族中不可或缺的一部分，它的主要功能包括在机体内生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)，维持机体内氧化还原平衡，其产生的ROS可以介导细胞增殖、迁移和分化等过程，并且被证明促进了EMT进程。 那么，TNF-α对于肺癌细胞的EMT进程是否有影响？TNF-α在以A549细胞为代表的肺腺癌细胞EMT进程中起到促进还是抑制的作用？TNF-α又与NF-κB、NOX4这些EMT进程中的因素之间是否有关系？因此，本实验使用TGF-β刺激A549细胞构建EMT模型，然后通过TNF-α作用于各组细胞以探讨TNF-α对EMT模型的影响，同时研究TNF-α、NF-κB和NOX4在此过程中的作用和联系，进而为肺癌的预防、诊断以及治疗提供有意义的实验基础和依据。 方法: 1、A549细胞EMT模型的构建:在A549细胞贴壁生长铺满细胞瓶底约80％时，用5μg/L的TGF-β刺激处理24h，以构建EMT模型。 2、实验分组:(1)TNF-α浓度的筛选:根据TNF-α浓度分别为0.00μg/L组、0.01μg/L组、0.02μg/L组、0.03μg/L组、0.04μg/L组、0.05μg/L组，利用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖活性以确定最佳浓度，并据此筛选出TNF-α作用于A549细胞的最优浓度;(2)探究TNF-α对EMT进程的影响时分为:对照组，TGF-β组，TNF-α组，TGF-β+TNF-α组;(3)探索TNF-α对于NF-κB信号通路、NADPH氧化酶4的影响:分为对照组，TGF-β组，TNF-α组和TGF-β+TNF-α组;(4)抑制NF-κB(p65)表达时分为:对照组，TGF-β组，TGF-β+TNF-α组，TGF-β+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组，TGF-β+TNF-α+BAY11-7082组。 3、细胞增殖活性的检测:通过CCK-8检测试剂盒来检测各处理组细胞的增殖活性，利用酶标仪检测每组细胞的吸光度值，然后进行计算以比较细胞的增殖活性。 4、细胞形态学的观察:通过活细胞工作站对各处理组细胞进行观察并选择具有代表性的细胞拍照留存，观察各组细胞形态并进行比较分析。 5、细胞迁移能力的检测:通过划痕实验来检测细胞的迁移能力，利用Photoshop软件对划痕进行分析，用相对宽度来表示。 6、蛋白水平的检测:通过WesternBlot检测EMT标志蛋白E-cadherin、Vimentin蛋白，NOX4蛋白以及信号通路蛋白NF-κB(p65)蛋白的表达。 7、统计学分析:实验中所获得的原始数据均采用均数±标准差形式来表示(x-±s，n=3)，实验所得数据全部应用SPSS27.0统计学软件进行分析，单因素方差分析(one-way ANOVE)用于多组间的均数比较，LSD-t检验(最小显著差异法)用于各组之间均数的两两比较，两独立样本t检验用于只有两组的分组均数比较，所设检测水准均为α=0.05。 结果 1、0.02μtg/L的TNF-α刺激A549细胞24h，与0.00μg/L组相比，细胞增殖活性显著降低(P＜0.001)。5μg/L的TGF-β刺激A549细胞24h，与对照组相比，TGF-β组E-cadherin蛋白表达显著减少，而Vimentin蛋白的表达显著增加，并且划痕实验显示:细胞间划痕宽度变小(P值均＜0.001)，说明其迁移能力增强。 2、TNF-α+TGF-β组与TGF-β组相比，E-cadherin蛋白表达明显增高，而Vimentin蛋白表达下降(P＜0.001);划痕实验显示:TNF-α+TGF-β组与TGF-β组相比，细胞间划痕宽度变宽(P＜0.001)，说明细胞迁移能力下降。 3、TGF-β组与对照组相比，NF-κB和NOX4蛋白表达上升(P＜0.001);TNF-α+TGF-β组与TGF-β组相比，NF-κB和NOX4蛋白表达均显著降低(P＜0.001)。 4、TGF-β组与对照组相比，细胞呈现长梭形，细胞间隙增大;TGF-β+BAY11-7082组与TGF-β组相比，细胞边缘钝圆，细胞数量变少，在TGF-β+TNF-α+BAY11-7082组则更为明显，细胞大多出现表皮细胞钝圆形态。TGF-β+BAY11-7082组与TGF-β组相比，E-cadherin蛋白表达明显增高而Vimentin、NF-κB(p65)和NOX4蛋白表达降低，差异均具有统计学意义(P＜0.001)。TGF-β+TNF-α+BAY11-7082组与TGF-β+TNF-α组相比，Vimentin蛋白表达明显增高而E-cadherin、NF-κB(p65)和NOX4蛋白表达均降低(P＜0.001)。 结论 TNF-α通过抑制TGF-β刺激A549细胞后激活的NF-κB/NOX4信号通路，进而抑制其EMT进程，并最终减弱A549细胞的迁移能力，减少肺癌细胞的扩散和转移。

关键词

肺癌/肺癌转化生长因子-β/肿瘤坏死因子-α/核转录因子-κB/NAPDH氧化酶4/上皮-间充质转化

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授予学位

硕士

学科专业

公共卫生

导师

周舫

学位年度

2021

学位授予单位

郑州大学

语种

中文

中图分类号

R73
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