摘要
细胞粘度(Cell Viscosity)是一项重要的微环境参数，对于维持细胞的正常生理功能(如生物分子间的信号传导，生物分子之间的相互作用，代谢物扩散以及细胞生长、凋亡、自噬等)具有重要意义。线粒体作为重要的亚细胞器，其粘度异常与多种疾病密切相关，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化以及恶性肿瘤等。在复杂的细胞环境中，线粒体粘度通常受到多种因素的影响。活性氧(Reactive Oxygen Species ,ROS)作为生物体内不断产生，且与细胞微环境密切相关的活性分子，其浓度变化与线粒体粘度之间可能存在着相关性。另外，随着环境污染的加重，重金属离子(Heavy Metal Ions)对人体健康的危害受到越来越多的关注。过量的重金属离子对线粒体粘度是否存在影响未见报道。基于此，我们设计合成了一种新型近红外荧光探针(Mito-NV)用于线粒体粘度实时原位的成像与分析，并利用该探针详细研究了H2O2及重金属离子对活细胞内线粒体粘度变化的影响。这对了解线粒体功能的执行以及相关疾病的发生发展机制具有重要的意义。 本论文主要内容包括下面两部分： 1、我们设计合成了一种新型近红外粘度荧光探针Mito-NV，用于线粒体粘度变化的实时原位检测。Mito-NV以4-吡啶乙腈为电子受体，二甲基苯胺为电子给体，基于扭曲的分子内电荷转移(TICT)原理设计而成。其分子结构由核磁共振氢谱、碳谱，及高分辨质谱进行了表征。在低粘度环境中，分子内单键高速旋转，Mito-NV荧光信号较弱；而在高粘度环境中，分子内单键的旋转受到抑制，Mito-NV产生强烈的近红外(685 nm)荧光信号。化学分析表明，Mito-NV对粘度具有良好的线性响应关系，不受极性、pH值变化以及细胞内含有的多种成分的影响。细胞实验表明，Mito-NV细胞毒性低，光稳定性好，并且可有效地靶向线粒体。在饥饿诱导和药物(制霉菌素、鱼藤酮)刺激后，Mito-NV能够很好地对线粒体粘度变化给予指示。总之，Mito-NV粘度探针灵敏度高，选择性好，为研究各种因素对细胞线粒体粘度影响提供了良好的工具。 2、我们利用Mito-NV分别探究了H2O2以及重金属离子对线粒体粘度的影响。首先，在外源性H2O2和内源性H2O2(PMA)刺激HepG2细胞后，用该探针对线粒体粘度进行可视化成像。实验结果显示，在外加H2O2和PMA诱导后，线粒体粘度显著增大。在重金属离子(Cu2+,Co2+,Cd2+)孵育HepG2细胞后，我们同样用Mito-NV对线粒体粘度进行可视化成像分析。实验结果显示，在重金属离子(Cu2+,Co2+,Cd2+)诱导后，线粒体粘度有所降低。以上结果表明H2O2和重金属离子会对线粒体粘度产生不同影响，这为进一步研究其他因素对线粒体粘度的影响提供了实验方法，同时也为相关疾病发生发展机制研究提供了一种可能的工具。
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