摘要
高尔基体和内质网是两个重要细胞器，它们在细胞中的蛋白质和脂质等生物大分子的修饰、分类和运输中发挥至关重要的作用。高尔基体和内质网中微环境(如极性、pH值等)的稳定性，维持着其正常生理功能的发挥。一旦高尔基体和内质网中的微环境稳态被打破，就会扰乱蛋白质的加工和运输过程，使蛋白质发生糖基化修饰错误或者错误折叠等异常变化，并大量累积在高尔基体和内质网中，不利于其正常功能的发挥。由于蛋白质参与细胞中多种生命活动，疾病的发生大多与蛋白质的异常变化密切相关。因此，高尔基体和内质网中微环境紊乱对蛋白质表达和功能的影响很可能是导致多种疾病发生发展的重要原因。有研究表明，在肿瘤、糖尿病、肝损伤、抑郁症和阿尔兹海默症等疾病中，高尔基体和内质网的极性和pH值往往都会偏离正常生理指标。但要想在细胞和活体内精确检测这些微环境指标的变化并不容易。因此，对高尔基体和内质网中的极性和pH进行准确、实时、定量监测，对于疾病的早期诊断和及时预防是十分必要的。然而，目前报道的微环境检测荧光探针仅有少数用于检测高尔基体和内质网中极性和pH。 为了探究细胞高尔基体和内质网中微环境与疾病的关系，我们在本文中设计合成了两种分别用于定量成像检测高尔基体极性与内质网pH水平的小分子荧光探针。两个探针都具有良好的选择性与生物相容性，可以应用于不同疾病过程中，细胞及活体内高尔基体极性与内质网pH的成像研究。 本文主要内容如下： 1、双光子荧光成像具有较低的光毒性、较深的组织穿透深度、较弱的背景干扰和较高的分辨率等优势。因此，我们设计合成了一种新型双光子比率成像探针TP-Golgi用于定量标定细胞及活体中高尔基体极性。TP-Golgi以对氨基苯磺酰胺为高尔基体靶向基团，半花菁衍生物为荧光团，不仅可以在体外定量检测溶液的极性，还可以用于细胞及活体的高尔基体中极性变化的灵敏检测。我们利用TP-Golgi检测了正常细胞和癌细胞中高尔基体的极性，发现癌细胞中高尔基体极性更低。我们还利用TP-Golgi成功地检测到脂多糖(LPS)和对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肾损伤(AKI)小鼠的肾脏中高尔基体极性的增加。此外，我们还利用TP-Golgi在检测AKI水平方面的应用，发现盐酸博来霉素(一种治疗宫颈癌等癌症的药物)处理的小鼠肾脏中高尔基体极性增加，表明其可能会导致AKI的发生。这一工作揭示了AKI水平与高尔基体极性增加之间的紧密联系，为AKI临床诊断提供了新的、有效的检测参数。 2、我们设计合成了一种能定量检测内质网中pH值变化的比率型荧光探针pH-ER。pH-ER以对甲基苯磺酰胺为内质网定位基团，半花菁衍生物为荧光团，并以酚羟基作为pH的响应基团。体外实验表明，pH-ER对pH具有灵敏、可逆的比率型响应，并且其在不同pH的PBS缓冲溶液中呈现不同的颜色现象，表明其具有开发成为pH试纸的潜力。细胞实验表明，pH-ER具有良好的内质网靶向性，可以用于细胞中内质网pH的定量检测。我们还利用pH-ER检测了发生内质网应激的细胞中内质网pH的变化，结果表明，在内质网应激过程中，细胞中内质网pH降低为6.30。接下来，我们计划利用探针pH-ER检测细胞凋亡过程中内质网pH的变化，然后进一步研究炎症组织中内质网pH的变化。
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