摘要
钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体感染引起的人畜共患传染病，其在全球范围内广泛传播，为人畜互源，自然疫源性传染病。被感染的人或动物出现黄疸、流产、脓毒血症、肝肾衰竭甚至死亡等症状。钩端螺旋体感染后在宿主的肾脏中长期定殖有并随尿液排出，其在潮湿的环境中可存活数月并保持感染性，严重威胁着公共卫生安全和畜牧业的发展。因此，揭示钩端螺旋体的入胞机制有助于靶向从源头控制其感染，减轻其对机体的损伤和钩端螺旋体尿的排出。但是目前少有关于钩端螺旋体入胞机制的研究。细胞脂筏是脂膜中的纳米级膜结构域，其富含胆固醇和鞘磷脂，包括多种信号转导蛋白和转运蛋白。已有报道表明越来越多的病原体的入胞过程需要脂筏的参与。本实验通过研究钩体入胞过程与脂筏的关系，为临床筛选有效防治钩端螺旋体病的药物提供理论基础。 首先在体外实验中验证脂筏是否和钩端螺旋体体入胞有关。用甲基β环糊精破坏J774A.1细胞的脂筏结构，钩端螺旋体感染40min后收集细胞，用qPCR检测钩端螺旋体特异性基因Lip32，结果表明胞内钩端螺旋体量明显减少，胆固醇恢复脂筏结构后，胞内钩端螺旋体量有所升高，同时，用Cav-1小RNA干扰实验破坏J774A.1细胞脂筏结构，qPCR结果同样显示胞内钩端螺旋体量明显降低，以上结果证明钩端螺旋体进入细胞需要脂筏的完整性。另外，在Vero细胞上进行了同样的实验，结果同样表明了钩端螺旋体进入细胞对脂筏的依赖性，并且证明了钩端螺旋体进入细胞需要脂筏与巨噬细胞的吞噬作用无关。在对胞内钩端螺旋体进行透射电子显微镜观察可知，J774A.1细胞在感染后第40min和第4h，脂筏破坏组的胞内钩端螺旋体量明显减少，并且钩端螺旋体的形态学发生改变，说明脂筏破坏后，细胞清除钩端螺旋体的能力增强。qPCR和细菌培养计数也证明了脂筏破坏组在感染4h后胞内钩端螺旋体基本被杀死。WesternBlot结果显示，脂筏被破坏后细胞自噬相关蛋白LC3-Π和LAMP的表达量升高，证明了自噬的激活。为了探究细胞清除钩端螺旋体能力的增强是否与细胞自噬有关，采用雷帕霉素和3MA分别刺激细胞后感染钩体，钩端螺旋体培养计数结果显示，雷帕霉素处理组胞内钩端螺旋体量明显降低，表明细胞自噬水平的提高有助于杀灭钩端螺旋体。以上研究工作表明，钩端螺旋体可以通过脂筏进入胞内，避免激活细胞自噬。 为了探究干扰细胞脂筏的药物能否起到抗钩端螺旋体感染的效果，我们分别用甲基β环糊精和甘草酸(一种从甘草根中分离出来的三萜甘，具有破坏细胞脂筏完整性的生物学功能)进行了体内体外实验。体外实验证明甘草酸二钾在预处理TCMK-1细胞2h后，能阻止钩端螺旋体进入细胞。不同动物模型的药物治疗效果显示，腹腔注射甲基β环糊精和甘草酸二钾并不能提高钩端螺旋体感染后金黄地鼠的存活率，证明甲基β环糊精和甘草酸二钾不能治疗急性钩端螺旋体病；但在慢性钩端螺旋体病模型中，感染5D后腹腔注射甲基β环糊精和甘草酸二钾能够明显缓解钩端螺旋体感染引起的肾脏病理损伤，并且减少肾脏中的钩端螺旋体定殖。通过ELISA检测肾脏中炎性细胞因子的分泌，结果表明甘草酸二钾能够降低肾组织炎性细胞因子(IL-1β，TNF-α)的释放；qPCR结果证明了治疗组肾脏中的钩端螺旋体量降低。体外实验对甘草酸二钾作用机制进行研究，qPCR检测炎性细胞因子和趋化因子的mRNA水平，结果证明甘草酸二钾能够减低钩端螺旋体感染引起的TCMK-1细胞的细胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-α)，趋化因子(RANTES，MCP-1)和iNOS的mRNA的表达；并通过ELISA方法检测细胞因子的分泌，结果证明甘草酸二钾能够减低钩端螺旋体感染引起的TCMK-1细胞的细胞因子(IL-1β，TNF-α)的分泌。Westernblot检测NF-κB和MAPK信号通路，结果证明甘草酸二钾抑制了钩端螺旋体感染引起的NF-κB和MAPK信号通路的活化。以上结果说明了甘草酸二钾通过抑制钩端螺旋体感染引起的NF-κB和MAPK信号通路的活化，抑制炎性细胞因子和趋化因子的表达，起到抗炎作用。 综上所述，本实验证明了钩端螺旋体进入细胞需要脂筏，破坏脂筏后，钩端螺旋体进入细胞的数量明显减少，并且细胞清除钩端螺旋体的能力增强，这与细胞自噬水平的升高有关。应用干扰细胞脂筏的药物甲基β环糊精和甘草酸二钾对急性钩端螺旋体病无效，但能够治疗慢性钩端螺旋体病。
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