摘要
维氏气单胞菌(Aeromonas.veronii. A.veronii)是一种人兽共患细菌，在广泛的温度和盐度范围都能存在，可以感染水生动物、陆生动物以及包括人类在内的哺乳动物，对公共卫生造成了巨大的威胁。脂蛋白(LPP)是细菌外膜的结构成分，对维持细胞膜的完整性有重要的作用；研究发现，LPP也参与了细菌的一些毒力过程如黏附，在细菌入侵的初期阶段发挥着关键作用。然而，A.veronii中LPP的研究较少，LPP对A.veronii的作用尚不清楚，本课题的目的是研究A.veronii中的LPP在该菌中的功能性作用，为A.veronii的致病机制研究以及为研发预防该菌的相关疫苗提供新思路。 首先，在全基因组测序的基础上，对脂蛋白基因(Lpp)进行原核表达，获得目的蛋白LPP，经纯化鉴定，免疫新西兰大白兔制备LPP抗血清研究其抗菌效应。通过PCR扩增Lpp基因，连接至pET-32a(+)载体，构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化感受态细胞BL21(DE3)，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达。表达产物经His标签镍离子蛋白纯化柱纯化，并采用SDS-PAGE和Westernblot鉴定。纯化的重组脂蛋白LPP免疫兔后制备抗血清，制备的抗血清皮下接种小鼠。结果显示，经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功；SDS-PAGE检测显示重组蛋白LPP分子量约为69Ku；Weternblot显示纯化后的重组蛋白LPP为单一条带；ELISA结果显示制备的抗血清的效价为1∶102400。结果表明本研究成功制备了LPP抗血清，该抗血清可以提高感染小鼠的生存率，减少脾脏荷菌量，对小鼠有一定的保护作用。 其次，本研究通过同源重组缺失Lpp基因，构建Lpp基因缺失株ΔLpp，并通过功能性互补构建互补株C-Lpp。通过PCR扩增Lpp基因的上下游同源臂后通过重叠PCR连接，连接至克隆载体pMD18-T，转化DH5α，结果显示重组克隆载体pMD18-T-L-12构建成功。之后连接Pre112自杀性质粒，依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞，结果显示重组自杀性质粒Pre112-L-12构建成功。测序成功的菌液作为供体菌和受体菌野生株WT结合转移，并筛选鉴定。qRT-PCR结果显示Lpp基因未表达；遗传稳定性结果显示ΔLpp可以稳定遗传。扩增含有启动子序列的Lpp基因，连接至克隆载体pMD18-T，转化DH5α，结果显示重组克隆载体pMD18-T-L-3构建成功。之后连接PBBR表达质粒，转化DH5α，结果显示重组表达载体PBBR-L-3构建成功。测序成功的菌液作为供体菌和受体菌缺失株ΔLpp结合转移，并筛选鉴定。qRT-PCR结果显示Lpp基因表达量约是WT的11倍；遗传稳定性结果显示C-Lpp可以稳定遗传。综上结果，本实验成功构建了A.veronii的脂蛋白缺失株ΔLpp和互补株C-Lpp，可以用于接下来的实验。 最后，本实验对ΔLpp和C-Lpp的生物学特性进行了分析。结果显示，ΔLpp和WT的生长速度相似，溶血活性没有明显变化，但ΔLpp的生物膜形成能力降低，鞭毛缺失，游动能力减弱，感染小鼠脾脏内的菌落数显著减少，细菌对小鼠的半数致死量升高；C-Lpp的生物学特性得到一定的恢复，但鞭毛部分缺失，游动能力减弱。结果表明，Lpp基因的缺失降低了A.veronii对小鼠的毒力，影响了该菌的致病性。综上，本实验制备的LPP抗血清可以有效的保护小鼠抵抗A.veronii的感染，此外，LPP参与了A.veronii的致病性，并发挥着关键的作用，该研究为揭示A.veronii的致病机制及研发抵抗该菌的保护性疫苗奠定了良好的基础。
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