摘要
背景 非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指在没有大量饮酒的情况下，以肝细胞脂肪变性为特征的一组疾病[1]。NAFLD包括两种不同预后的病理特点:无炎症或纤维化的单纯脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，其中后者可能进展为纤维化、肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。NAFLD是慢性肝病的重要病因之一，已成为一个重要的公共健康问题，影响着全球20％-30％的人口，并在世界范围内呈上升趋势[3]。 NAFLD的发生发展机制尚未完全明确。它被认为涉及遗传易感性变异、饮食环境因素、胰岛素抵抗、以及肠道菌群变化之间的复杂联系[4]。这些因素之间的相互作用导致脂代谢紊乱，过多的脂质积累在肝细胞中，最终促使NAFLD的进展。越来越多的证据表明，人类肠道微生物群与多种疾病有关，如炎症性肠病、结直肠癌、帕金森病、双相障碍等[5]。肝脏与肠道在解剖位置和功能上都具有密切的联系。肠道微生物通过肠-肝循环，在肝脏炎症、损伤、慢性纤维化及肿瘤发生发展中扮演重要的角色[6]。研究显示，肠道菌群失调会导致肠道粘膜屏障破坏，肠道通透性增高，从而促使细菌移位，产生内毒素血症，菌群产生的脂多糖可激活TLR4/NLRP3炎性小体途径，进而增加肝脏脂肪含量和炎症反应[7]。Hoyles等的一项多国合作研究，通过综合分析非糖尿病肥胖女性脂肪肝患者的多组学特征，提出患者的肠道菌群基因丰富度降低，菌群的膳食脂质代谢增强，合成芳香族和支链氨基酸的能力增加，且肝脏表达免疫炎症等基因的能力增强，并通过粪便微生物群移植实验表明肠道菌群可引发脂肪肝[8]。 NAFLD的发病率通常与肥胖症、Ⅱ型糖尿病和代谢综合征的流行程度平行[9]。然而，很明显，并不是所有的肥胖者都会发展成NAFLD，更重要的是，NAFLD也存在于非肥胖个体中，其组织病理学表现与肥胖NAFLD患者相似[10]。在全球范围内，非肥胖NAFLD的报告患病率差异很大，从3％到30％不等[11]。这种差异性可能归因于研究对象的选择、诊断方式以及特定人群的生活方式和饮食习惯的差异。东西方非肥胖NAFLD的流行数据并没有直接的可比性，至少部分原因是定义肥胖的身体质量指数(Body mass index，BMI)的临界值不同。对于亚洲人，指南推荐BMI大于25kg/m2定义为肥胖，而建议西方人群BMI大于30kg/m2为肥胖[12]。和肥胖NAFLD相比，非肥胖NAFLD人群在肠道微生物组成上有何特征，这一问题在很大程度上仍未被探索。 目的 为理解BMI对NAFLD人群肠道微生物特征的影响，本课题基于粪便菌群宏基因组测序数据，研究非肥胖NAFLD和肥胖NAFLD人群的肠道微生物群落结构，同时利用生物信息学方法探索与非肥胖NAFLD相关的重要物种。 方法 1.从郑州大学第一附属医院中国健康整合组学项目队列(Chinese Healthy Integrative-omics Project，CHIP)中选取183例NAFLD患者，收集其新鲜粪便标本。NAFLD入选对象均符合2010年中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的《非酒精性脂肪性肝病诊断标准》。排除病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病及其他可致脂肪肝的特殊病例，排除合并其他严重疾病患者。以BMI=25kg/m2为分界值将研究对象分为两组。其中，BMI＜25kg/m2的非肥胖NAFLD患者52例，BMI≥25kg/m2的肥胖NAFLD患者131例。此外，从CHIP项目队列中随机选取31例非肥胖的健康对照者(nonobese HC)和20例肥胖的健康对照者(obese HC)，收集其粪便标本。 2.研究对象的人口学特征、实验室检查结果、影像学检查报告从医院的电子病历系统中收集。通过调查问卷获取研究对象的既往史、用药史、饮酒史。 3.从研究对象中收集新鲜的粪便样本后，迅速将样本冰冻并保存在-80℃冰箱内。通过DNA的提取，测序文库的构建、宏基因组测序，测序数据的处理，得到粪便菌群的宏基因组测序信息。 4.采用R4.0.2(http://www.R-project.org/)的“vegan"软件包分析菌群的α多样性，用以下参数进行表示:Observedspecies，Shannon指数，Simpson指数，Gini指数。采用R4.0.2的“phyloseq"软件包进行主坐标分析(PCoA)，计算菌群的β多样性即样本之间的距离。 5.采用R4.0.2分析统计数据。采用Wilcoxon检验比较两组间的连续变量，Fisher精确检验比较两组间的分类变量。P＜0.05视为差异具有统计学意义。 结果 1.本研究共纳入183例非酒精性脂肪性肝病患者，其中非肥胖NAFLD患者52例，肥胖NAFLD患者131例。在非肥胖NAFLD组和肥胖NAFLD组之间，两者的性别、年龄无统计学差异(P＞0.05);非肥胖NAFLD组的舒张压、腰围、臀围显著低于肥胖NAFLD组，高密度脂蛋白显著高于肥胖NAFLD组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与非肥胖NAFLD组相比，肥胖NAFLD组的白细胞和尿酸显著升高，差异具有统计学差异(P＜0.05)。此外，两组通过Fibrotouch测定的脂肪衰减参数和肝脏组织硬度值未见统计学差异(P＞0.05)。 2.非肥胖NAFLD组肠道微生物群落的Shannon指数和Simpson指数均显著高于肥胖NAFLD组(P=0.0096，P=0.0071)，Gini指数显著低于肥胖NAFLD组(P=0.029)，差异有统计学意义。非肥胖NAFLD组和肥胖NAFLD组在观测的物种数目上保持一致，未见统计学差异。结果表明非肥胖NAFLD组和肥胖NAFLD组在物种多样性上存在差异，且非肥胖NAFLD组的物种多样性高于肥胖NAFLD组。 3.基于HellingerDistance(HD),Jense-ShannonDivergence(JSD),Bray-CurtisDistance和Pearson-CoefficientDistance，在第一主成分水平上，非肥胖NAFLD组和肥胖NAFLD组可以完全区分开(P＜0.05)。综合上述四种样品间距离，提示非肥胖NAFLD组和肥胖NAFLD组在一些主要菌群的组成上存在差异。 4.通过对物种组成进行分析，结果提示非肥胖NAFLD组中Bacteroidesovatus,Ruminococcusbromii,Bacteroidesuniformis,Roseburiainulinivorans,Bacteroidesfragilis，Bacteroidesthetaiotaomicron等28个物种的相对丰度显著增加;Bacteroidescoprocola,Megamonasfuniformis,Megamonashypermegale,Haemophilusparainfluenzae等8个物种的相对丰度在肥胖NAFLD组中显著增加。在非肥胖NAFLD组中富集的28个物种分别来自厚壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。肥胖NAFLD组中富集的8个物种分别来自厚壁菌门，拟杆菌门和变形菌门。 5.通过肠道菌群和临床指标的相关性分析，结果提示:富集在非肥胖NAFLD中的Bacteroidescellulosilyticus等14个物种与BMI显著负相关(P＜0.05)，Clostridiumasparagiforme等10个物种与HDL显著正相关。此外，富集在肥胖NAFLD中的物种Ruminococcuscallidus的丰度与空腹血糖(rho=0.2457，P=0.0008)和脂肪衰减参数FAP(rho=0.1467，P=0.048)显著正相关。 6.进一步分析非肥胖健康对照和肥胖健康对照组的肠道菌群特征，两组间的α多样性未见显著差异。通过比较NAFLD和健康人群各组间的特征性菌群，说明BMI对机体肠道菌群的影响具有异质性。 结论 本研究利用宏基因组测序技术对NAFLD人群的粪便菌群结构进行全面分析，研究发现，BMI对NAFLD的肠道菌群特征具有显著影响，非肥胖NAFLD和肥胖NAFLD在菌群的组成、丰富度和多样性上差异显著。卵形拟杆菌、布氏瘤胃球菌、单形拟杆菌、Roseburiainulinivorans，脆弱拟杆菌，多形拟杆菌，cellulosilyticus拟杆菌等物种在非肥胖NAFLD中显著富集，菌群结构的改变和菌群代谢产物可能与阻止非肥胖NAFLD进展有关。我们的研究结果为NAFLD的肠道菌群疗法提供理论依据。
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