摘要
目的: 在全球范围内，胶质瘤是一种最为常见的侵袭性原发脑部肿瘤，成年人中较常见。根据病理学和临床标准，世界卫生组织(WHO)将胶质瘤分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级胶质瘤，其中，Ⅳ级胶质瘤即多形胶质母细胞瘤(GBM)占成人所有原发性恶性脑肿瘤的近80％。2016年WHO加入了分子病理诊断，IDH野生/突变型鉴别也成为胶质瘤分子病理分型的基本依据。而在胶质瘤的治疗上，手术、放疗、化疗方面已经取得了进步，不少患者获益，但GBM患者的中位生存期仍仅为14.6个月。在多种肿瘤治疗中取得不俗效果的免疫疗法对于胶质瘤特别是GBM，效果仍不理想。而根据近年来的研究提示，胶质瘤特殊的肿瘤微环境有可能导致其免疫逃逸，但相关的机制和分子标志物研究仍不充分。本研究尝试从已有的转录组学数据库进行生物信息学挖掘，拓展影响胶质瘤表型的基因种类。综合使用TCGA、GEO、单细胞转录组学等多种公共数据库的转录组学数据，利用多种生信分析工具来挖掘与胶质瘤相关的新标志物，发现了SOX基因家族多个成员与胶质瘤密切相关，且SOX9高表达于肿瘤细胞，与患者较差临床预后正相关。现有研究表明，SOX9基因是性染色体Y上性别决定基因SRY相关高迁移率组盒SOX超家族的一员，具有高度保守的HMG结构域，可以调控干细胞行为、参与胚胎发育和性别决定，另外还是多种恶性肿瘤的癌基因，在胰腺癌、胃癌、结肠癌、皮肤癌、乳腺癌等样本中，都存在SOX9异常高表达现象。在胶质瘤中SOX9的异常高表达已有人注意到，相关研究目前主要集中于研究SOX9在胶质瘤耐药、干细胞维持、肿瘤增殖等活动中的作用，方法学上多局限于体外细胞培养与病理组织免疫组化分析，机制研究也有所欠缺。为进一步研究SOX9在胶质瘤中的作用，本研究借助目前已有的转录组学数据库，在初步分析胶质瘤转录组学数据后，采用LASSO回归筛选变量，建立了以SOX9为主导因素的胶质瘤风险预测模型，通过基因差异表达与富集分析、聚类、伪时间分化轨迹与细胞通讯分析，发现高表达SOX9的恶性细胞主要分为AQP1阳性细胞/TNFRSF12A阳性细胞，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、招募髓系免疫抑制细胞(如BMM)，这参与了胶质瘤免疫抑制微环境的形成、增强了免疫逃逸。研究中还使用胶质瘤组织芯片进行了免疫组化实验，从蛋白表达水平上对SOX9与胶质瘤患者临床预后的关系进行了分析与验证。本研究表明，SOX9的高表达可导致胶质瘤患者预后不良，并分析了潜在的分子机制，这对开发新的胶质瘤肿瘤标志物，以进行早期检测和预后评估，对改善治疗策略等具有重要意义。 方法: 1.进行泛癌分析，利用Oncomine在线分析工具，分析SOX家族基因在各种常见肿瘤中表达情况。 2.在癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达数据库(GTEx)，进行癌组织与正常组织表达情况的比较，并分析包括GBM和LGG组织在内的各种癌症类型中SOX基因的表达水平，验证胶质瘤中SOX家族基因表达水平。 3.利用GEO单细胞测序转录组数据，进一步验证胶质瘤中，恶性肿瘤细胞在SOX家族基因上表达的差异。 4.使用LASSO回归筛选变量，建立SOX风险预测模型，采用单因素和多因素COX回归分析，确定SOX表达与胶质瘤临床病理特征的相关性。 5.进行基因差异表达分，功能注释和富集分析，分析高危胶质瘤中不同基因和功能信号的反应情况。 6.利用高危低危组转录组数据，对肿瘤样本中基质细胞和免疫细胞进行评分，在bulk-seq层面上评价胶质瘤的免疫微环境。 7.利用免疫细胞反卷积、拟时序轨迹重建、Cellchat等方法对单细胞转录组数据进行分析，以评价SOX9在特定细胞簇中的表达及其与细胞增殖和免疫活动的关系，以及细胞间相互作用。 8.对胶质瘤组织芯片进行免疫组化染色，确定SOX9蛋白表达情况，结合样品的临床资料，明确SOX9基因表达情况与肿瘤增殖、患者的预后之间的关系。 结果: 1.胶质瘤中存在SOX家族基因成员表达上调现象，SOX9是胶质瘤风险因子。 2.以LASSO回归筛选到的SOX3/6/8/9基因，构建了胶质瘤风险预后模型。 3.依据风险模型对患者分组，对高/低危组差异表达基因功能注释与通路富集，发现高危胶质瘤的增殖、免疫、炎症、缺氧微环境等活动增强。 4.高风险因素与肿瘤免疫抑制微环境显著相关。 5.SOX风险模型预测神经胶质瘤单细胞测序中的良性和恶性亚簇。 6.TNFRSF12A阳性细胞和AQP1阳性细胞增加细胞增殖、侵袭和微环境免疫抑制。 7.SOX9表达上调的患者预后不良。
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