摘要
紫花苜蓿(Medicago sativa.L)是优良的豆科牧草，因其良好的饲用价值在世界范围内广泛种植。近年来，气候变化引起的土壤盐渍化问题严重影响了紫花苜蓿的产量和品质。因此，解析紫花苜蓿响应盐胁迫的分子机制势在必行。作为植物抵御非生物逆境的重要因子，WRKY转录因子在近些年多有报道，然而其在紫花苜蓿中的研究较少。本研究通过对紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的作用机制进行分析，探究其在紫花苜蓿抵御盐胁迫过程中的生物学功能，结果如下: 1、利用同源克隆的方法分离得到紫花苜蓿MsWRKY33基因，生物信息学研究表明MsWRKY33蛋白包含两个典型的WRKY结构域，为I类WRKY转录因子，亚细胞定位结果表明MsWRKY33蛋白定位于细胞核上。 2、构建MsWRKY33启动子融合GUS表达载体转化拟南芥，GUS组织化学染色发现MsWRKY33基因主要在根部及叶片的叶脉处表达，表明该基因的表达具有组织特异性，且盐胁迫能够诱导MsWRKY33增强表达。 3、qRT-PCR分析显示MsWRKY33高表达于紫花苜蓿的根和叶组织中，且其能够被NaCl、PEG、低温、高温四种逆境胁迫所诱导表达。此外，MeJA、SA、GA3和ABA四种激素均能诱导MsWRKY33的增强表达，且对GA3和ABA的响应更为迅速。 4、酵母单杂交试验发现MsWRKY33能够与W-box顺式作用元件特异性结合，同时也可与ACS2、PAD3和CYP71A13基因上游启动子结合。 5、转录激活试验表明MsWRKY33的转录激活域位于MsWRKY33序列的N端(P1段)，并通过酵母筛库实验，得到3个与MsWRKY33互作的蛋白，分别为MsCAMBP、MsMpv17和MsPRPS10，并将这3个蛋白通过酵母双杂交技术和BiFC技术与MsWRKY33进行一对一互作验证，发现MsWRKY33与MsCAMBP在细胞核有较强的互作关系，与MsMpv17和MsPRPS10没有互作关系或互作关系较弱。 6、通过农杆菌介导法转化“中苜1号”获得了过表达MsWRKY33的紫花苜蓿，盐胁迫下，转基因紫花苜蓿中SOD、POD和CAT三个抗氧化酶的活性显著高于非转基因苜蓿，表明MsWRKY33可以提高转基因材料的耐盐性;qRT-PCR分析发现CYP71A13、ACS2和PAD3三个基因的表达均能被盐诱导且表达量远高于非转基因植株。 综上所述，MsWRKY33通过调控下游ACS2、PAD3和CYP71A13三个耐盐基因的表达，同时影响了体内抗氧化酶的活性，从而调控紫花苜蓿的耐盐性。研究解析了MsWRKY33转录因子的生物学功能，初步阐述了MsWRKY33调控紫花苜蓿耐盐性的分子机理，并获得了过表达MsWRKY33的紫花苜蓿株系。
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