摘要
猪血凝性脑脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis，PHE）是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）引起的猪的一种急性传染病，临床上以呕吐、衰竭以及中枢系统障碍为主要特征，病死率约为30％~100％。PHEV为β冠状病毒属成员之一，其基因组主要编码5种结构蛋白，其中纤突糖蛋白（S）以同源三聚体形式存在，构成了病毒表面的独特纤突结构。三聚体S糖蛋白包含主要的抗原和抗病毒中和决定簇，在介导病毒入侵以及诱导中和抗体产生方面起着关键作用，是疫苗开发的主要靶点。S蛋白可在结构和功能上划分为两个亚基，即S1和S2。S1（N末端球状头）负责与宿主细胞受体结合，S2负责膜融合机制。 接种疫苗是预防和控制传染病最为经济、有效的公共卫生干预措施，但目前仍无市售的PHEV疫苗产品，严重阻碍了临床上PHE防治工作的开展。鉴于此，本研究拟以PHEV S蛋白为靶标，研制新型高效的DNA亚单位疫苗，以期为防控PHEV感染流行提供重要的技术储备。本研究首先构建了表达不同长度S基因的真核质粒，经真核表达系统鉴定正确后，大量制备候选DNA疫苗，即pFUSE-S1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD。将候选疫苗与佐剂（A1）预混，分别免疫小鼠，免疫组设置如下：pFUSE-S1、pFUSE-S1+A1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△TM+A1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD+A1、pFUSE、pFUSE+A1。每周采集免疫受试小鼠血液，分离血清后，检测PHEV特异性抗体、PHEV中和抗体、细胞因子IFN-γ以及IL-4水平。结果表明，三组候选疫苗免疫小鼠后，小鼠血清内特异性抗体水平，随着免疫天数的增加逐渐升高；其中，pFUSE-S△TM组特异性抗体水平最高。pFUSE-S△TM组的中和抗体水平最高，效价可达1∶22，显著高于空载体对照组；其次pFUSE-S△CD组，效价水平可达1∶20，显著高于空载体对照组。三组疫苗的IFN-γ水平都显著高于对照组，其中pFUSE-S△TM组IFN-γ水平最高，可达106.7pg/mL；三组疫苗的IL-4水平都显著高于对照组，其中pFUSE-S△TM组IL-4水平最高，可达80.7pg/mL。免疫35天后，每组随机选取3只小鼠脱颈处死，无菌分离脾脏，进行T淋巴细胞亚群检测。结果表明，三组候选疫苗均可以诱发T淋巴细胞增殖，其中pFUSE-S△TM组CD3+CD4+淋巴细胞百分数高达48.9％，CD3+CD8+淋巴细胞百分数高达70.6％，极显著高于对照组。免疫35天后进行攻毒保护试验，每日观察小鼠精神状态，攻毒结束后进行脑组织病毒载量检测和脑组织HE染色，结果显示，各疫苗免疫组小鼠精神状态均好于空载体对照组。三组候选疫苗组的小鼠脑组织病毒载量均低于对照组，差异显著；脑部病理组织学检查显示，疫苗免疫组小鼠脑部损伤程度均轻于空载体对照组。 上述结果表明，本研究研制的DNA亚单位疫苗pFUSE-S1、pFUSE-S△TM、pFUSE-S△CD均可在不同程度上引起机体的细胞免疫和体液免疫，其中以疫苗pFUSE-S△TM，pFUSE-S△CD的效果最优，更适合作为疫苗的候选株，为未来猪血凝性脑脊髓炎病毒疫苗的研发提供了参考。
NETL