摘要
酒精滥用与酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是美国和世界范围内的一个主要公共卫生问题。作为ALD的最初阶段，酒精性脂肪性肝病（Alcoholic fatty liver disease，AFLD）的主要特点是脂质在肝细胞中不断积累并可能进一步发展为酒精性脂肪性肝炎(Alcoholic steatohepatitis,ASH)、酒精性肝硬化(Alcoholic cirrhosis,AC)和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等不可逆肝损害。因此，寻找有效的脂质积累靶点和处理方法，在初始阶段阻断ALD的进一步发展对于ALD的治疗是必不可少的。 脂肪酸β-氧化参与肝脏脂质代谢，而脂质代谢紊乱与AFLD密切相关。研究表明，低氧诱导因子-2a（Hypoxia-inducible factor-2a,Hif-2α）在肝病患者中表达水平很高，Hif-2α失活可通过脂肪酸代谢调控作用逆转肝癌的进展[1]。而在AFLD中，Hif-2α与脂肪酸β-氧化之间的具体调控机制尚未研究。本实验旨在探讨Hif-2α在AFLD中的作用以及Hif-2α调控肝脏脂肪变性可能的分子机制。研究内容如下： 1.Hif-2α在乙醇喂养的小鼠肝脏和乙醇诱导的AML-12细胞中的表达。 我们采用经典的Gao-Binge造模法，在小鼠体内制造AFLD模型。油红O染色结果显示，乙醇喂养组小鼠肝脏呈现明显脂质积累，且血清ALT、AST活性、TG、T-CHO含量和肝指数也明显上升；Hamp;E染色结果显示，乙醇喂养组小鼠肝脏呈现一定程度肝损伤；体外油红O染色结果同样表明，100mM乙醇刺激AML-12细胞48h后出现大量脂质沉积。 在乙醇喂养的小鼠肝脏和乙醇诱导的AML-12细胞中，参与脂肪酸β-氧化的两个关键酶：CPT-1α和MCAD表达水平均下降。IHC染色、RT-qPCR和Western blotting结果一致显示：Hif-2α在乙醇喂养的小鼠肝脏和乙醇诱导的AML-12细胞中呈现高表达。IF染色结果显示，乙醇刺激AML-12细胞48h后，Hif-2α荧光强度明显增加，且Hif-2α主要在细胞核内染色水平提高，Western blotting分析进一步证实了这一发现。 2.Hif-2α对乙醇喂养的小鼠肝脏和乙醇诱导的AML-12细胞中脂肪酸β-氧化水平的影响。 为了进一步确定Hif-2α与脂肪酸β-氧化之间的潜在关系，自乙醇喂养小鼠第10天起，每日灌胃给予Hif-2α特异性抑制剂PT2399（10mg/kg）一次，持续一周。油红O染色和Hamp;E染色分别显示，PT2399治疗组小鼠肝脏脂滴数量减少、肝损伤程度减轻；小鼠血清ALT、AST活性、T-CHO、TG含量和肝指数均显著下降；脂肪酸β-氧化相关蛋白：MCAD、CPT-1α表达水平上升。 在AML-12细胞中，采用Hif-2α-siRNA质粒建立Hif-2α沉默细胞模型，同时给予乙醇刺激AML-12细胞48h。Western blotting结果显示，Hif-2α-siRNA处理组中MCAD和CPT-1α蛋白表达水平上升。细胞上清液TG生化分析显示，Hif-2α-siRNA处理组中脂质沉积明显减少。采用2.0uM的PT2399处理AML-12细胞并给予乙醇刺激48h后，脂肪酸β-氧化相关蛋白：CPT-1α与MCAD表达变化与Hif-2α-siRNA处理组中相一致。油红O染色和TG生化分析结果也与Hif-2α-siRNA处理组中相一致。 3.Hif-2α对乙醇喂养的小鼠肝脏和乙醇诱导的AML-12细胞中BNIP3依赖的线粒体自噬活性的影响。 RT-qPCR和Western blotting结果显示，乙醇喂养组线粒体自噬相关基因：BNIP3、Beclin1和LC3II的mRNA和蛋白表达水平下降，而这一现象被PT2399所逆转。透射电镜（TEM）分析显示，对照组小鼠肝脏中线粒体形态正常并分裂活跃，而乙醇喂养组小鼠肝脏线粒体大量肿胀而无分裂，且脂肪空泡数量增加，自噬体数量减少。经PT2399治疗后，大部分损伤线粒体恢复到几乎完整的线粒体形态和分裂活性，且脂肪空泡数量减少，自噬体数量增加。 Western blotting进一步分析显示，体外乙醇组中BNIP3、Beclin1和LC3II/LC3I蛋白表达水平下降。IF分析表明，乙醇组中LC3与Mito Tracker Red（MTR）共定位水平下降、BNIP3和LC3荧光斑点重叠数量减少。将Hif-2α-siRNA转染至AML-12细胞中，同时给予乙醇刺激48h。Western blotting结果显示，Hif-2α-siRNA处理组中BNIP3、Beclin1和LC3II/LC3I蛋白表达水平有所提高，这与PT2399处理组中结果相一致。IF分析表明，Hif-2α-siRNA和PT2399处理均提高LC3和MTR共定位水平、增加BNIP3和LC3的荧光斑点重叠数量。然而，当Hif-2α-siRNA和BNIP3-shRNA同时转染至AML-12细胞中并给予乙醇刺激48h，Western blotting结果显示，BNIP3、Beclin1和LC3II/LC3I蛋白表达水平受到抑制。 4.Hif-2α对乙醇诱导的AML-12细胞中脂肪酸β-氧化水平的调控机制研究。 Western blotting结果显示，Hif-2α-siRNA和PT2399处理均明显促进PPAR-α/PGC-1α信号通路相关蛋白：PPAR-α和PGC-1α的表达。将pc-DNA3.1-BNIP3转染至AML-12细胞中，建立过表达BNIP3细胞模型，同时给予乙醇刺激AML-12细胞48h。Western blotting结果显示，pc-DNA3.1-BNIP3处理组中BNIP3、Beclin1和LC3II/LC3I蛋白表达水平明显上升。IF分析还发现，pc-DNA3.1-BNIP3处理组中LC3和MTR共定位水平、BNIP3和LC3的荧光点重叠数均有所增加，且PPAR-α/PGC-1α信号通路相关蛋白、MCAD和CPT-1α蛋白表达水平均提高。然而，在Hif-2α-siRNA与BNIP3-shRNA共处理组中，这些蛋白表达水平均下降。 总之，这些观察结果表明，Hif-2α通过BNIP3依赖的线粒体自噬途径负调控PPAR-α/PGC-1α信号通路，抑制肝脏脂肪酸β-氧化水平，从而加重AFLD的发生发展。
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